呂學軍 陸衛(wèi)忠 張永娟 郭 亮 李少瑩 李玉英 錢桂生

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)與急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是當前危重疾病領域最為重視的研究熱點之一。長期以來，國內外學者對該病進行了大量研究，但迄今為止ALI/ARDS的發(fā)病機制仍不清楚[1]。肺泡上皮細胞為典型的極性細胞，細胞極性的變化與細胞功能密切相關，如分泌功能、液體清除功能、膜通道等。研究證實，ALI/ARDS時，肺泡上皮細胞存在極性損傷，而這種極性損傷在ALI/ARDS早期扮演重要角色。

新近研究發(fā)現(xiàn)，Clathrin蛋白是維持上皮細胞極性所必須的重要蛋白。Clathrin基因的沉默會干擾細胞膜基底外側蛋白的運輸和再循環(huán)從而使其失去極性，但是對頂端蛋白的極性沒有影響[2]。因此，Clathrin對于上皮細胞的極性維持和調節(jié)起到關鍵作用，但Clathrin在ALI/ARDS發(fā)生時具體作用機制仍不明確。如能分離Clathrin相互作用蛋白，對于闡明Clathrin在ALI/ARDS肺泡上皮極性損傷中的具體作用機制具有重要價值。

因此，本研究應用酵母雙雜交技術從小鼠肺cDNA文庫中篩選與Clathrin相互作用蛋白，進一步闡明Clathrin在ALI/ARDS發(fā)生時肺泡上皮極性損傷中的具體作用機制。

材料與方法

一、pSos-Clathrin誘餌載體構建

按小鼠Clathrin基因序列設計相應引物，以含有Clathrin編碼序列的質?？寺槟０澹謩e在上游和下游引物引入BamH1及SalⅠ酶切位點 (上游引物為：5′-ACGGGATCCATATGGCTGAGGACTTCGGCTTC-3′， 下游引物為： 5′-ACGCGTCGACCTAGCGGGACAGTGGTGTTTG-3′)，PCR擴增Clathrin基因全長，產物長度：710 bp。PCR產物純化后經BamH1和SalⅠ酶切，回收后與經相同條件酶切回收的pSos載體連接，構建重組載體pSos-Clathrin，酶切鑒定后測序。

二、Clathrin誘餌蛋白自激活實驗

將下列質粒共轉化到制備好的感受態(tài)細胞中。

陽性對照組(Positive control)：pSos MAFB + pMyr SB

陰性對照組(Negative control)：pSos MAFB + pMyr Lamin C

實驗組(Experiment group)：pSos Clathrin + pMyr SB； pSos Clathrin + pMyr Lamin C

7 d后平板上長出克隆，將克隆分別接種至兩塊SD/glucose (-UL)平板和兩塊SD/galactose (-UL)平板上。觀察克隆生長情況，確定誘餌蛋白自激活特性。

三、Clathrin 誘餌蛋白表達檢測

分別接種轉化pSos/Clathrin及pSos空載體的cdc25H酵母細胞至SD/-Leu培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，離心收集酵母細胞，完全裂解酵母細胞，提取蛋白，經SDS-PAGE電泳，轉移到PVDF膜，封閉液封閉2 h，加入兔抗Sos蛋白多克隆抗體(1︰200)，結合4 h，羊抗兔IgG(1︰1000)二抗結合1 h后曝光，顯影定影。

四、Clathrin小鼠肺cDNA文庫篩選及陽性克隆驗證

將pSos-Clathrin質粒和pMyr-小鼠肺cDNA文庫質粒共轉至感受態(tài)的酵母細胞中并將轉化產物接種到SD/galactose (-UL)瓊脂平板。25 ℃孵育48 h，隨后轉入37 ℃孵育。7 d后，挑取62個克隆并重鋪在SD/glucose (-UL)瓊脂平板上，25 ℃孵育5 d。再將其分別重鋪在SD/glucose (-UL) 平板和SD/galactose(-UL) 平板上，找出37 ℃下在SD/galactose (-UL)平板上生長，而在SD/glucose (-UL)平板上不生長的克隆。分別擴增含有陽性克隆的酵母細胞后提取文庫質粒DNA并酶切鑒定。進一步對篩選得到的陽性克隆進行回轉驗證。對回轉驗證結果為陽性的文庫克隆質粒送檢測序，分析克隆序列。

結 果

一、pSos-Clathrin誘餌載體構建

重組載體pSos-Clathrin經酶切并測序鑒定。結果表明插入的Clathrin基因序列及插入方向完全正確。酶切鑒定結果如圖1。

圖1 pSos-Clathrin重組載體酶切鑒定結果

二、Clathrin誘餌蛋白自激活實驗

轉化鋪板6 d后所有平板上均長出克隆，取少許克隆培養(yǎng)物分別接種至兩塊SD/glucose (-UL)平板和兩塊SD/galactose (-UL)平板上。7 d后觀察各平板上克隆生長情況，如圖2、圖3。

圖2 各轉化組在25 ℃ SD/Glucose(-UL)和SD/Galactose(-UL)平板生長情況

圖3 各轉化組在37 ℃ SD/Glucose(-UL)和SD/Galactose(-UL)平板生長情況

結果顯示，對照組在各溫度及缺陷平板上關系正確。實驗組在25 ℃ SD/Glucose(-UL)和SD/Galactose(-UL)平板上均有生長；在37 ℃SD/Glucose(-UL)平板上， 兩組均無生長； 在37 ℃ SD/Galactose(-UL)平板上，pSos Clathrin + pMyr SB生長，而pSos Clathrin+pMyr Lamin C不生長，表明Clathrin無自激活作用，適用于CytoTrap膜蛋白文庫篩選系統(tǒng)。

三、Clathrin 誘餌蛋白表達檢測

實驗組在相對分子量145×103水平位置可檢測到Sos-Clathrin融合蛋白的表達。空載體對照組可在相對分子量120×103左右處檢測到Sos蛋白的表達，如圖4。

注：Lane 1：轉化pSos/Clathrin組；Lane 2：pSos空載體對照組

四、Clathrin蛋白小鼠肺cDNA文庫篩選及陽性克隆驗證

文庫轉化物鋪至大平板7～10 d以后，從37 ℃半乳糖平板上共挑取了62個克隆，將細胞重鋪在SD/glucose (-UL)瓊脂平板上，在25℃孵育5 d。大部分細胞可長出克隆，將長出的克隆的細胞分別復制接種在一個SD/glucose (-UL) 平板和一個SD/galactose (-UL) 平板上，37 ℃孵育約5 d。在SD/galactose (-UL)平板上生長，而在SD/glucose (-UL)平板上不生長的克隆為陽性克隆。經過兩輪驗證之后，共有10個克隆被初步確定為陽性克隆。擴增前一步得到的10種含有陽性克隆的酵母細胞后，提取其中含有的文庫質粒DNA。轉化大腸桿菌XL1-blue感受態(tài)細胞后，小量提取質粒。用EcoRI和XhoI雙酶切鑒定，得到的外源片斷從相對分子量0.5×103到1.8×103不等，如圖5。

圖5 純化質粒的酶切電泳結果

五、陽性文庫質粒與誘餌質?；剞D驗證

將篩選得到的陽性文庫質粒和誘餌質粒，共轉化到酵母感受態(tài)細胞中。將每個轉化反應鋪在SD/glucose(-UL) 平板上，25 ℃倒置孵育5 d。在每個平板上挑取2個菌落，并將其重鋪在一個SD/glucose (-UL) 平板和一個SD/galactose(-UL) 平板上，在37 ℃孵育約48 h。在SD/galactose (-UL)平板上生長，而在SD/glucose (-UL)平板上不生長的克隆可以驗證蛋白之間的相互作用。實驗組10個克隆在37 ℃孵育48 h后，4種克隆在SD/galactose (-UL)平板上可以生長，而在SD/glucose (-UL)平板上不能生長，其余6種克隆在兩種平板上均無法生長，提示以上4種克隆與Clathrin蛋白之間存在相互作用，如圖6。4種陽性送檢測序。

圖6 陽性克隆回轉驗證結果

六、陽性測序結果

將陽性克隆2，4，5，8送測序，并通過生物信息學軟件對測序結果進行分析。結果如下：

克隆2：Mus musculus adenylate cyclase-associated protein 1 (yeast)

克隆4：Mus musculus filamin, alpha

克隆5：Mus musculus DAP kinase-related apoptotic kinase 2 (Drak2)/Mus musculus serine/threonine kinase 17b (apoptosis-inducing) (Stk17b)

克隆8：Mus musculus G protein-coupled receptor kinase 6 (Grk6), transcript variant 1, mRNA

討 論

酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉錄調控中建立。典型的真核生長轉錄因子等都含有二個不同的結構域：DNA結合結構域(DNA-binding domain, BD)和轉錄激活結構域(transcription-activating domain, AD)。前者可識別DNA上的特異序列，并使轉錄激活結構域定位于所調節(jié)的基因的上游，轉錄激活結構域可同轉錄復合體的其他成分作用，啟動它所調節(jié)的基因的轉錄。酵母雙雜交技術即利用上述特性，將酵母的轉錄因子的兩個功能域分解，由編碼BD和AD的DNA片段與需要研究的蛋白質(X和Y)的cDNA分別構建重組體BD-X和AD-Y。如果蛋白質X和Y之間存在相互作用，則BD和AD被拉近，轉錄活性恢復，即可激活下游報告基因的表達[3]。因此應用酵母雙雜交技術可以分析已知蛋白質之間是否存在相互作用。

通過酵母雙雜交技術篩選的與已知蛋白相互作用的蛋白質，其功能往往密切相關，彼此相互調節(jié)，共同參與某些病理生理過程，這對于闡明各種生物現(xiàn)象的分子機理和基因作用機制具有重要意義。本研究應用pSos酵母雙雜交篩選系統(tǒng)，以pSos-Clathrin為誘餌質粒篩選小鼠肺cDNA 文庫，得到與Clathrin相互作用的4種蛋白質，并在酵母細胞中初步驗證了它們的相互作用。

在這篩選到的4種蛋白質中，腺苷酸環(huán)化酶關聯(lián)蛋白1(CAP1)首先是在酵母中發(fā)現(xiàn)的。CAP能和肌動蛋白單體結合，肌動蛋白是細胞保持形態(tài)和細胞運動的基本單位，肌動蛋白的單體通過聚合和解聚，完成細胞的運動。在肌動蛋白由單體組合成多聚體及多聚體解聚成單體的循環(huán)利用過程中，CAP發(fā)揮了重要作用?；蚯贸鼵AP1后，細胞肌動蛋白的裝配速度明顯減慢[4]，在酵母細胞敲除CAP1后，體積增大，出芽模式不規(guī)則，肌動蛋白的裝配也會紊亂[5]。而敲除了CAP1后Dictyostelium(一種真菌)會出現(xiàn)細胞極性的改變[6]。果蠅的CAP缺失也會影響其卵細胞極性的維持[7]。以上資料表明CAP1表達的異常使得肌動蛋白裝配紊亂，進而影響細胞的形態(tài)、極性和遷徙。

細絲蛋白ɑ(Filamin ɑ)作為非肌性肌動蛋白結合蛋白，結構保守，表達廣泛。細絲蛋白ɑ主要通過動態(tài)調節(jié)肌動蛋白的聚合、解聚、分支、交聯(lián)和捆束參與細胞骨架的動態(tài)重構，改變細胞的形態(tài)和運動以應對外界刺激，定向細胞運動在胚胎發(fā)育期間的機體器官發(fā)育過程中具有重要意義[8]。

DAP凋亡誘導蛋白激酶2(DRAK2)屬于死亡相關蛋白激酶家族(DAP kinase, DAPK)，是一類新的鈣離子/鈣調素依賴激酶，使其底物蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化。研究表明DRAK2與T細胞免疫和細胞凋亡有關[9-10]。

G蛋白耦聯(lián)受體激酶(G protein-coupled receptor kinase,GRK)是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶。至今已克隆出7種亞型的GRK，其中GRK6 廣泛分布于心臟、腦、肺和胎盤等各種組織。研究表明GRK6 與炎癥調控、凋亡細胞的清除、腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉移以及藥物成癮性等有關[11-14]。

通過酵母雙雜交篩選的4種與Clathrin相互作用蛋白的可靠性可進一步通過免疫共沉淀技術進一步驗證，但其相互作用機制，包括極性損傷和調節(jié)細胞凋亡等尚有待深入研究。

參 考 文 獻

1 金發(fā)光. 急性肺損傷的診治研究現(xiàn)狀及進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2013， 6(1)： 1-3.

2 Deborde S, Perret E, Gravotta D, et al. Clathrin is a key regulator of basolateral polarity[J]. Nature, 2008, 452 (7188): 719-723.

3 Fields S, Sternglanz R. The two-hybrid system: an assay for protein-protein interactions[J]. Trends Genet, 1994, 10(8): 286-292.

4 Bertling E, Hotulainen P, Mattila PK, et al. Cyclase-associated protein 1 (CAP1) promotes cofilin-induced actin dynamics in mammalian nonmuscle cells[J]. Mol Biol Cell, 2004, 15(5): 2324-2334.

5 Gerst JE, Ferguson K, Vojtek A, et al. CAP is a bifunctional component of the Saccharomyces cerevisiae adenylyl cyclase complex[J]. Mol Cell Biol, 1991, 11(3): 1248-1257.

6 Noegel AA, Blau-Wasser R, Sultana H, et al. The Cyclase-associated Protein CAP as regulator of cell polarity and cAMP signaling in dictyostelium[J]. Mol Biol Cell, 2004, 15(2): 934-945.

7 Baum B, Perrimon N. Spatial control of the actin cytoskeleton in Drosophila epithelial cells[J]. Nat Cell Biol, 2001, 3(10): 883-890.

8 Pollard TD, Borisy GG. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments[J]. Cell, 2003, 112(4): 453-465.

9 Weist BM, Hernandez JB, Walsh CM. Loss of DRAK2 signaling enhances allogeneic transplant survival by limiting effector and memory T cell responses[J]. Am J Transplant, 2012, 12(8): 2220-2227.

10 Mao J, Luo H, Wu J. Drak2 overexpression results in increased beta-cell apoptosis after free fatty acid stimulation[J]. J Cell Biochem, 2008, 105(4): 1073-1080.

11 Tarrant TK, Rampersad RR, Esserman D, et al. Granulocyte chemotaxis and disease expression are differentially regulated by GRK subtype in an acute inflammatory arthritis model (K/BxN)[J]. Clin Immunol, 2008, 129(1): 115-122.

12 Nakaya M, Tajima M, Kosako H, et al. GRK6 deficiency in mice causes autoimmune disease due to impaired apoptotic cell clearance[J]. Nat Commun, 2013, 4: 1532.

13 Raghuwanshi SK, Smith N, Rivers EJ, et al. G protein-coupled receptor kinase 6 deficiency promotes angiogenesis, tumor progression, and metastasis[J]. J Immunol, 2013, 190(10): 5329-5336.

14 Raehal KM, Schmid CL, Medvedev IO, et al. Morphine-induced physiological and behavioral responses in mice lacking G protein-coupled receptor kinase 6[J]. Drug Alcohol Depend, 2009, 104(3): 187-196.