黃麗芳，殷緒明，陳智勇，肖亮，易自力*

(1.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

芒(Miscanthus sinensis)再生體系的建立和優(yōu)化

黃麗芳1，殷緒明1，陳智勇2，肖亮2，易自力2*

(1.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

以芒(Miscanthus sinensis)的幼穗為材料，通過(guò)外植體消毒滅菌、愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化增殖、生根和馴化移栽，建立芒組織培養(yǎng)的快速繁殖體系。結(jié)果表明：芒愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基是MS+4.0 mg/L 2,4–D + 1.0 mg/L 6–BA + 0.5 mg/L CuSO4，愈傷組織誘導(dǎo)頻率達(dá)99.33%；不定芽分化和增殖的最佳培養(yǎng)基分別為MS+1.0 mg/L 6–BA + 0.4 mg/L NAA + 0.4 mg/L IAA和MS+ 3.0 mg/L 6–BA +1.5 mg/L PP333+1.0 mg/L CCC，分化率為96%，增殖系數(shù)為9.1；生根培養(yǎng)基選用MS+0.5 mg/L IAA + 0.5 mg/L NAA + 0.5 mg/L CCC + 0.5 mg/L PP333，生根率達(dá)100%；將再生苗移栽至用黃土和營(yíng)養(yǎng)土配制的基質(zhì)上，其成活率高達(dá)95%，且生長(zhǎng)勢(shì)良好。

芒；能源植物；離體培養(yǎng)；正交設(shè)計(jì)；方差分析

筆者以多年生芒的幼穗為材料，通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化增殖、生根和馴化移栽，擬建立芒組織培養(yǎng)的快速繁殖體系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為多年生芒(M. sinensis)，編號(hào)為B0634，采集于長(zhǎng)沙，種植在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬能源植物資源圃。該芒草是從1 000多份野生資源中篩選出的優(yōu)良株系，其植株高大，根狀莖發(fā)達(dá)，抗逆性強(qiáng)，生物質(zhì)產(chǎn)量高。

1.2 方 法

1.2.1 外植體的消毒

在孕穗期，選取穎花花原基形成期和花粉母細(xì)胞形成期的幼穗(旗葉剛抽出不久)，剪取幼穗的莖稈上端，剝?nèi)ト~鞘和外層苞葉，保留最后一層苞葉，用70%乙醇徹底擦拭葉鞘和莖稈，然后在超凈工作臺(tái)上用0.1%氯化汞消毒15 min，無(wú)菌水清洗5次，放置在無(wú)菌濾紙上，吸干外植體表面水分，剝出幼穗后備用。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)

用無(wú)菌剪刀將幼穗剪成長(zhǎng)約1 cm小段接入MS培養(yǎng)基中，分別添加2,4–D(2.0、4.0、6.0 mg/L)、6–BA(0.5、0.8、1.0 mg/L)和CuSO4(0.0、0.5、1.0 mg/L)，并用鑷子將其撥散，使其與培養(yǎng)基充分接觸，放置培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)，溫度控制在(24±2) ℃。3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(2,4–D、6–BA和CuSO4) 采用L9(33)正交設(shè)計(jì)，配合使用。每個(gè)處理接種5皿。每皿30個(gè)穗段。重復(fù)3次。每7 d觀察1次。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)出愈率。

1.2.3 不定芽的分化培養(yǎng)

挑取新鮮、顆粒狀、直徑2～5 mm的黃綠色或乳白色胚性愈傷接入 MS培養(yǎng)基中，分別添加6–BA(0.5、1.0、2.0 mg/L)、NAA(0.2、0.4、0.6 mg/L) 和IAA(0.2、0.4、0.6 mg/L)。3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(6–BA、NAA和IAA)采用L9(33) 正交設(shè)計(jì)，配合使用。每個(gè)處理接種5皿。每皿25塊愈傷。重復(fù)3次。每5 d觀察1 次。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)分化率。

1.2.4 不定芽的增殖培養(yǎng)

待幼苗長(zhǎng)至1～3 cm時(shí)，分成小芽叢轉(zhuǎn)至增殖培養(yǎng)基中。增殖培養(yǎng)基在 MS培養(yǎng)基中分別添加6–BA (1.0、2.0、3.0 mg/L)、PP333(0.5、1.0、1.5 mg/L) 和CCC (0.5、1.0、1.5 mg/L)。培養(yǎng)室溫度控制在(24±2) ℃，光照12 h/d，光強(qiáng)約為2 000 lx。3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑采用L9(33) 正交設(shè)計(jì)，配合使用。每個(gè)處理接種15瓶。3芽一叢，每瓶15芽。重復(fù)3次。每7 d觀察1次新芽的生長(zhǎng)情況。新增殖的不定芽長(zhǎng)度達(dá)到 0.5 cm以上才計(jì)數(shù)，30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽增殖倍數(shù)(增殖倍數(shù)=增殖芽數(shù)／接種芽數(shù))。

1.2.5 試管苗的生根誘導(dǎo)

待不定芽長(zhǎng)至3.0～5.0 cm時(shí)，接種到MS+IAA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+CCC 0.5 mg/L+PP3330.5 mg/L生根培養(yǎng)基上。培養(yǎng)室溫度控制在(24±2) ℃，光照12 h/d，光強(qiáng)約為2 000 lx。每個(gè)處理接種50個(gè)芽。重復(fù)3次。每7 d觀察1次。30 d后統(tǒng)計(jì)生根率。

1.2.6 試管苗的馴化移栽

挑選具有4～5片葉的生根試管苗，置室溫下培養(yǎng)7 d左右，打開(kāi)瓶蓋后煉苗3～4 d，從培養(yǎng)瓶中取出，分成單株，用自來(lái)水清洗黏附在根部的培養(yǎng)基(以防止?fàn)€根)，然后移入裝有消毒基質(zhì) (黃土與營(yíng)養(yǎng)土的體積比為3∶1) 的盆缽中。移栽后，前15 d使用有頂玻璃罩蓋好，之后每隔7 d噴水1次。溫室栽培成活后的試管苗，移栽到大田。移栽時(shí)，為保證高的移栽成活率，避免在正午烈日下種植。容器苗由于是帶基質(zhì)移栽，根系不會(huì)受到傷害，種植后立即澆定根水。每個(gè)處理移栽100株苗，重復(fù)3次。每3 d觀察1次，30 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

采用正交設(shè)計(jì)助手進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)效果

接種后約 7 d，幼穗兩端切口處開(kāi)始伸長(zhǎng)、膨大；接種后15 d左右，切口處陸續(xù)出現(xiàn)乳白色的愈傷組織小團(tuán)；接種后25 d轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)后，愈傷組織加速增大，并向四周擴(kuò)展，局部出現(xiàn)綠點(diǎn)，隨即有少量綠色芽點(diǎn)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上分化成小芽(圖1–B)。

圖1 芒幼穗離體培養(yǎng)及植株再生Fig.1 In vitro culture and plant regeneration from immature inflorescences of Miscanthus sinensis

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同濃度2,4–D處理形成的愈傷組織形態(tài)結(jié)構(gòu)各不相同。根據(jù)Armstrong等[17]的標(biāo)準(zhǔn)可將愈傷組織分為3類：Ⅰ類呈乳白色或淺黃色，顆粒狀，結(jié)構(gòu)致密，容易分化出再生植株，2,4–D質(zhì)量濃度為 2.0 mg/L時(shí)形成的愈傷組織多為該類型；Ⅱ類呈黃綠色，外植體細(xì)胞旺盛增生并完全愈傷化，顆粒狀，質(zhì)地松軟，長(zhǎng)期繼代仍有胚性，能通過(guò)胚狀體途徑再生，2,4–D質(zhì)量濃度為4.0 mg/L時(shí)的愈傷組織多為該類型；Ⅲ類呈黃褐色，質(zhì)地較硬，復(fù)雜多樣，產(chǎn)生的胚狀體較少，不易長(zhǎng)期繼代，且難以分化成再生植株，2,4–D質(zhì)量濃度為6.0 mg/L時(shí)形成的愈傷組織與此相似。

表1 芒幼穗愈傷組織誘導(dǎo)的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The result of callus induction from immature inflorescences of Miscanthus sinensis through orthogonal experiment

由表1可以看出，不同質(zhì)量濃度2,4–D處理誘導(dǎo)率的極差最大(R=48.67)；其次為 6–BA 的(R=11.33)；CuSO4的最小(R=8.77)，說(shuō)明在參試的3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中，2,4–D對(duì)芒幼穗愈傷組織誘導(dǎo)的影響最大，其次為6– BA，CuSO4的影響較小。方差分析結(jié)果和極差判斷結(jié)果相一致，即2,4–D不同濃度水平之間誘導(dǎo)率的差異均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。

續(xù) 表

多重比較結(jié)果(表 1)表明，A2B3C2、A2B1C3、及A2B2C1等3種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率均在87%以上，對(duì)幼穗愈傷組織的誘導(dǎo)率顯著高于其他6種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率，差異達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，因此，誘導(dǎo)愈傷組織的最佳2,4–D質(zhì)量濃度為4.0 mg/L。同時(shí)附加的6–BA質(zhì)量濃度應(yīng)介于0.5～1.0 mg/L，愈傷組織誘導(dǎo)率隨著 6–BA質(zhì)量濃度的增加而升高，愈傷組織表面綠色芽點(diǎn)越多，質(zhì)量濃度為 1.0 mg/L時(shí)達(dá)到最高，為99.33%，極顯著高于其他處理(Y4除外)。另外，附加CuSO4能明顯促進(jìn)芒幼穗愈傷組織的形成，在添加0.5 mg /L CuSO4的培養(yǎng)基上表現(xiàn)最好，10 d左右開(kāi)始形成胚性愈傷組織，并且愈傷組織的質(zhì)量比較高，呈緊密的白色顆粒狀，生長(zhǎng)迅速。由此可見(jiàn)，芒愈傷組織誘導(dǎo)添加的激素及最佳配比為4.0 mg/L 2,4–D+1.0 mg/L 6–BA+ 0.5 mg/L CuSO4。

2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)芒芽分化的影響

對(duì)影響芒植株再生的因子，通過(guò)正交試驗(yàn)方法優(yōu)化組合(表2)。乳白色胚性愈傷在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后出現(xiàn)綠色小芽點(diǎn)，15 d左右芽開(kāi)始伸長(zhǎng)，并再生出叢生狀的綠色植株的莖葉，隨后大多數(shù)培養(yǎng)基中的叢生芽不斷增加，且生長(zhǎng)健壯(圖 1–C)，有部分芽的根部逐漸形成發(fā)達(dá)的根系，長(zhǎng)成完整的小植株。

表2 芒幼穗愈傷組織分化的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of callus differentiation from spike of Miscanthus sinensis through orthogonal experiment

由接種 30 d后的分化率(表 2)可知，6–BA、NAA、IAA的極差分別為47.67、6.11、0.89，說(shuō)明6–BA對(duì)叢生芽分化誘導(dǎo)產(chǎn)生的效應(yīng)最大，其次為NAA ，IAA產(chǎn)生的效應(yīng)最小。方差分析結(jié)果表明，6–BA不同濃度水平分別對(duì)芒再生體系的影響達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，NAA各水平對(duì)芒不定芽分化的影響達(dá)到顯著水平( P＜0.05)，而IAA 各水平對(duì)芒不定芽分化的影響較小。說(shuō)明不同濃度水平的6–BA對(duì)芒不定芽分化誘導(dǎo)的影響最大，NAA則次之，這與直觀分析的結(jié)果相一致。由于IAA對(duì)芒叢生芽分化和增殖誘導(dǎo)的影響較小，可以不考慮其影響。綜合考慮，各因子的最佳組合為 A1B2C2，即1.0 mg/L 6–BA、0.4 mg/L NAA 和0.4 mg/L IAA。

2.3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)芒芽增殖的影響

培養(yǎng)7 d左右，基部開(kāi)始長(zhǎng)出綠色的小芽點(diǎn)，15 d左右逐漸生長(zhǎng)出不定芽。在W1、W2、W3試驗(yàn)培養(yǎng)基上不定芽伸長(zhǎng)快，試管苗平均高度達(dá)8.5 cm，葉色綠，生長(zhǎng)健壯；在W4、W5、W6試驗(yàn)培養(yǎng)基上幼芽均勻一致，平均高度達(dá)5.5 cm，生長(zhǎng)良好；在W7、W8、W9試驗(yàn)培養(yǎng)基上新生芽矮化，平均高度僅為3.8 cm，節(jié)間短，葉色綠，生長(zhǎng)健壯。

由表3可以看出，不同質(zhì)量濃度6–BA處理誘導(dǎo)率的極差最大(R=5.19)；其次為PP333的(R=1.41)；CCC的最小(R=0.79)，對(duì)芒不定芽增殖影響的主次因素依次為 6–BA、PP333、CCC。這說(shuō)明對(duì)于芒不定芽增殖起主要作用的是6–BA，其次是PP333，CCC對(duì)增殖的影響較小。方差分析結(jié)果和極差判斷結(jié)果相一致，即6–BA不同濃度之間誘導(dǎo)率的差異均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。從試驗(yàn)中可見(jiàn)，矮壯素和多效唑抑制芒試管苗的莖生長(zhǎng)，高濃度(1.0～1.5 mg/L)多效唑和矮壯素，能顯著提高芒增殖系數(shù)，縮短節(jié)間長(zhǎng)度，降低莖高，而且使用效果十分顯著(圖1–D)。低濃度(0.5 mg/L)多效唑和矮壯素處理的培養(yǎng)基中雖然也有芽的分化，但芽的質(zhì)量較差，成苗質(zhì)量不高，苗高而弱。

綜上所述，芒不定芽增殖培養(yǎng)的最佳處理為A3B3C2，即4.0 mg/L 6–BA、1.5 mg/L PP333和1.0 mg/L CCC。芒不定芽在此配方上的增殖倍數(shù)達(dá)到9.1。

表3 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)叢生芽增殖影響的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Effects of medium compositions on the production of shoot clumps

2.4 生根誘導(dǎo)培養(yǎng)

芒試管苗在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d左右，長(zhǎng)出3～5條、長(zhǎng)3～4 cm粗壯的根系，生根率達(dá)100%。

2.5 移栽與定植結(jié)果

將移栽后的芒試管苗在溫室培養(yǎng)30 d左右，待新葉長(zhǎng)出、新根形成時(shí)視為已成活，成活率高達(dá)95%以上，且生長(zhǎng)旺盛(圖1–E)。移栽大田后，根系從原來(lái)容器狹小的空間中解脫出來(lái)，有利于對(duì)養(yǎng)分的吸收。植株生長(zhǎng)迅速，頂端優(yōu)勢(shì)十分明顯。經(jīng)過(guò)2年的生長(zhǎng)觀察，試管苗長(zhǎng)勢(shì)整齊一致，株形美觀挺拔，植株高大，平均生長(zhǎng)高度達(dá) 1.5 m以上(圖1–F)。

3 結(jié)論與討論

1) 芒幼穗再生體系的建立和優(yōu)化是可行和高效的。本試驗(yàn)對(duì)影響芒幼穗愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織分化及增殖培養(yǎng)的因子進(jìn)行優(yōu)化，初步探明了愈傷誘導(dǎo)、植株再生、叢生芽增殖的主要影響因子，從而使芒愈傷組織誘導(dǎo)率和叢生芽分化率都明顯高于已有的研究：如愈傷組織誘導(dǎo)率高于 K. G?owacka等[18]報(bào)道的結(jié)果(76.7% )；叢生芽分化率高于E.S. Seong等[19]報(bào)道的最高分化率。另外，本試驗(yàn)摸索出的組織培養(yǎng)體系的優(yōu)勢(shì)還體現(xiàn)在叢生芽長(zhǎng)期繼代而增殖系數(shù)基本不下降。此技術(shù)體系短期內(nèi)可獲得大量的叢生芽。

2) 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)芒幼穗再生體系的影響。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和濃度對(duì)芒的誘導(dǎo)和分化有較大的影響[18–19]。在愈傷組織誘導(dǎo)方面，2,4–D是最有效激素之一，最佳質(zhì)量濃度為2.0～4.0 mg/L，高濃度不僅降低誘導(dǎo)率，而且大幅度降低植株再生率。在本試驗(yàn)中，當(dāng)2,4 –D質(zhì)量濃度超過(guò)4.0 mg/L，愈傷組織的誘導(dǎo)率明顯下降；6–BA是叢生芽分化和增殖的主要生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，1.0 mg/L 6–BA最利于芒再生芽的形成，并且與其他水平達(dá)到極顯著差異；3.0 mg/L 6–BA最利于叢生芽的增殖，而且叢生芽增殖表現(xiàn)出很強(qiáng)的群體效應(yīng)，不僅培養(yǎng)時(shí)間縮短，而且增殖系數(shù)高。

3) 其他試驗(yàn)因子對(duì)芒再生體系的影響。多效唑能抑制植物體內(nèi)赤霉素的生物合成；矮壯素是赤霉素的拮抗劑，因而二者都能起到增強(qiáng)光合作用、促進(jìn)作物莖稈粗壯、縮短節(jié)間距、調(diào)節(jié)株型、防止倒伏的作用。從試驗(yàn)中可見(jiàn)，矮壯素抑制芒試管苗的莖生長(zhǎng)，隨著矮壯素質(zhì)量濃度的增加，其莖長(zhǎng)受抑制程度逐漸增大，試管苗莖稈變粗，葉面積增大。Chi等[20]證明在草地早熟禾品種Kenblue的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.01 mg/L CuSO4能顯著提高誘導(dǎo)率、生長(zhǎng)速率和胚性愈傷率，而0.5 mg/L CuSO4能提高再生率。本研究中也獲得了初步的成果，在培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L CuSO4時(shí)，愈傷組織從含水量高、水漬狀轉(zhuǎn)為表面干燥、具有顆粒狀結(jié)構(gòu)，并且出現(xiàn)了緊密的白色胚性愈傷組織，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率較高，且易分化出苗。

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責(zé)任編輯：蘇愛(ài)華

英文編輯：羅 維

Establishment and optimization of a regeneration system for Miscanthus sinensis

HUANG Li-fang1, YIN Xu-ming1, CHEN Zhi-yong2, XIAO Liang2, YI Zi-li2*
(1.Key Laboratory of Agro-ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China; 2.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

The rapid propagation system was established using the spike of Miscanthus sinensis as material through explants sterilization, adventitious bud differentiation and multiplication, rooting and transplanting acclimation. The results showed that the optimal medium for callus induction was MS+ 4.0 mg/L 2,4–D + 1.0 mg/L 6–BA + 0.5 mg/L CuSO4, with which the induction frequency reached 99.33%. Best adventitious bud differentiation and multiplying medium was MS+ 1.0 mg/L 6–BA + 0.4 mg/L NAA + 0.4 mg/L IAA and MS+ 3.0 mg/L 6–BA + 1.5 mg/L PP333+ 1.0 mg/L CCC, with which the differentiation rate was 96% and the multiplying coefficient was 9.1. The best medium for rooting induction was MS+ 0.5 mg/L IAA + 0.5 mg/L NAA + 0.5 mg/L CCC + 0.5 mg/L PP333, with which the rooting rate was 100%. The regenerated plantlets grew well on the matrix consisting of loess and nutrition soil, and the survival rate was as high as 95%.

Miscanthus sinensis; energy plant; in vitro culture; orthogonal design; variance analysis

10.13331/j.cnki.jhau.2014.06.004

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks

S543+.9

A

1007?1032(2014)06?0583?06

芒(Miscanthus sinensis)系禾本科(Poaceae)芒屬(Miscanthus)的一種 C4多年生高大草本植物，俗稱“芒草”，主要分布于東亞和東南亞地區(qū)。因芒具有生物質(zhì)產(chǎn)量大[1–2]、纖維素含量高[3]、灰分含量低[4]、燃燒值高[5]、生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)[6]、栽培成本低等優(yōu)點(diǎn)，而被公認(rèn)為是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的新型能源植物。早在20世紀(jì)90年代，歐美地區(qū)一些國(guó)家將從日本引進(jìn)的一種芒草(M. giganteus)作為首選能源植物開(kāi)展了一系列研究，并推出了能源芒草商業(yè)品種[7–8]。中國(guó)是芒草的自然分布中心，從北緯 18°～43°，東經(jīng)97°～126°都有芒草生長(zhǎng)，其種質(zhì)資源極為豐富。近年來(lái)，中國(guó)也已啟動(dòng)了能源芒草的研發(fā)工作，在種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與篩選[9–10]、遺傳多樣性分析[11–14]、品種培育與改良[15–16]等方面都已開(kāi)展了研究，但有關(guān)種苗繁殖技術(shù)的研究尚少見(jiàn)報(bào)道。由于芒草是一種異交植物，種子苗遺傳分離大，出苗率低，其自然繁殖多以無(wú)性繁殖為主，種苗繁殖已成為制約芒草大規(guī)模人工栽培的一個(gè)瓶頸問(wèn)題，因此，建立其體細(xì)胞大規(guī)模離體快繁技術(shù)體系，是滿足能源芒草產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用種苗需求的有效途徑。

2014–04–08

國(guó)家“ 863”課題(2011AA10020901)；美國(guó)孟德?tīng)柹锛夹g(shù)公司合作項(xiàng)目( SR0373)

黃麗芳(1976—)，女，回族，湖南中方人，碩士，助理研究員，主要從事生物新能源品種選育與栽培技術(shù)研究，hlf20060829@ 163.com；*通信作者， yizili889@163.com