張 麗 趙 輝 季 輝 孫義田

(河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肺病科，河北 滄州 061001)

實(shí)驗(yàn)研究

射干麻黃湯加味對(duì)哮喘小鼠肺組織過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ表達(dá)的影響※

張 麗 趙 輝 季 輝 孫義田

(河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肺病科，河北 滄州 061001)

目的探討射干麻黃湯加味對(duì)慢性哮喘小鼠肺組織過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)表達(dá)的影響。方法將50只健康清潔級(jí)雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、地塞米松組、射干麻黃湯組及射干麻黃湯加味組，每組各10只。建立慢性哮喘小鼠模型后，各藥物組分別予相應(yīng)藥物干預(yù)，正常對(duì)照組及模型組予0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。連續(xù)4周后取各組小鼠肺組織，采用免疫組織化學(xué)染色(SP法)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)小鼠肺組織內(nèi)PPAR-γ的數(shù)量及轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠的PPAR-γ的數(shù)量及轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加(P<0.05)，經(jīng)地塞米松組處理后PPAR-γ的數(shù)量及轉(zhuǎn)錄表達(dá)有所降低(P<0.05)，而射干麻黃湯及射干麻黃湯加味組均有所增加(P<0.05)，射干麻黃湯加味組尤為明顯(P<0.05)。結(jié)論射干麻黃湯加味可抑制BALB/c哮喘小鼠哮喘的發(fā)生，其機(jī)制有可能是通過(guò)升高PPAR-γ的數(shù)量及轉(zhuǎn)錄表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

哮喘；疾病模型，動(dòng)物；動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)；小鼠；射干麻黃湯；介子；地龍；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptors-γ，PPAR-γ)是由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于Ⅱ型核受體超家族成員。該受體活化后可以調(diào)控多種核內(nèi)靶基因表達(dá)，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，特別是與哮喘患者氣道炎癥反應(yīng)存在密切關(guān)聯(lián)[1]。射干麻黃湯是傳統(tǒng)中醫(yī)治療哮喘的常用方劑，我們通過(guò)臨床反復(fù)對(duì)比、優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)射干麻黃湯加味治療哮喘具有更加明顯的療效。本研究的目的在于探討射干麻黃湯加味對(duì)于慢性哮喘小鼠肺組織PPAR-γ表達(dá)的影響，從而在分子水平探討其防治哮喘的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性BALB/c小鼠50 只，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(黑)-2006009，飼養(yǎng)溫度25.0～26.0 ℃，相對(duì)濕度60%～70%，晝夜明暗交替各12 h。

1.1.2 藥物與試劑 射干麻黃湯(藥物組成：射干15 g，麻黃9 g，生姜9 g，半夏9 g，紫菀6 g，款冬花6 g，五味子3 g，細(xì)辛3 g，大棗6 g)，生藥由我院中藥房提供，用蒸餾水1 000 mL先煎麻黃5 min后入余藥，共水煎2次，然后過(guò)濾，濃縮為100 mL，每mL含生藥0.66 g。射干麻黃湯加味為射干麻黃湯加芥子9 g、地龍6 g，生藥由我院中藥房提供，用蒸餾水1 000 mL先煎麻黃5 min后入余藥，共水煎2次，然后過(guò)濾，濃縮為100 mL，每mL含生藥0.81 g。腹腔致敏液(主要成分為卵蛋白10 μg及氫氧化鋁20 μg，福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀氨基酸有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020515)；PPAR-γ一抗(美國(guó)Santa Cruz公司)；SP免疫組化試劑盒(武漢博士生物工程德公司)；RT-PCR試劑盒(武漢博士生物工程德公司)；瓊脂糖(哈爾濱晶美生物技術(shù)公司)；Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen Corp公司)。

1.1.3 主要儀器 霧化吸入器(PW.1型，上海醫(yī)療器械廠有限公司)，自制玻璃霧化箱(50 cm×40 cm×25 cm)，全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀(Model550型，美國(guó)BIO-RAD公司)，定量PCR儀(ABI 7500型，美國(guó)ABI公司)，凝膠電泳成像系統(tǒng)(Gene Genius，美國(guó)Syngene公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備 實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、地塞米松組、射干麻黃湯組及射干麻黃湯加味組，每組各10只。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠于實(shí)驗(yàn)第1、15 d分別腹腔注射致敏液0.2 mL，第22 d開(kāi)始于霧化吸入25 g/L卵蛋白，每日1次，每次30 min，連續(xù)4周建立哮喘動(dòng)物模型。同時(shí)正常對(duì)照組予等容積0.9%氯化鈉注射液霧化吸入。

1.2.2 給藥方法 第22 d起，射干麻黃湯組及射干麻黃湯加味組小鼠在每次霧化吸入前 30 min分別予相應(yīng)藥液0.5 mL灌胃；地塞米松組予地塞米松注射液0.26 mL(含生藥為0.65 mg/kg)腹腔注射；正常對(duì)照組及模型組予0.26 mL 0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，連續(xù)干預(yù)4周。

1.3 標(biāo)本采集 末次霧化吸入24 h后以10%水合氯醛溶液400 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉后，迅速開(kāi)胸，暴露氣管、雙肺，結(jié)扎右總支氣管，于遠(yuǎn)端切下，右肺上葉放入10%中性甲醛溶液中，余放入液氮中保存。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 肺組織PPAR-γ表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)染色(SP法)，石蠟切片，脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。微波抗原修復(fù)，然后按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以磷酸緩沖鹽(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。兔抗鼠PPAR-γ抗體工作濃度為1∶100。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色陽(yáng)性結(jié)果呈棕黃色，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.4.2 肺組織PPAR-γmRNA表達(dá) 采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)，提取RNA；逆轉(zhuǎn)錄(RT)合成cDNA：按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，引物設(shè)計(jì)與合成：PPAR-γ和gapdh序列由Genebank獲得，以Primer3軟件設(shè)計(jì)引物，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司代為合成。

Gapdh：5'-ACCATAGTCCATGCCATCAC-3'

3'-TCCATCACCCTGTTGCTGTA-5'；

PPAR-γ：5'-GGTTGATTTTCTCAGCGTTTC-3'

3'-TCAATCGGATGGTTCTTCGA-5'。

依次加入正反引物各0.5 μL，cDNA產(chǎn)物1 μL，10×緩沖液2.5 μL，氯化鎂2 μL，dNTP(10 mM)0.5 μL，Taq酶0.5 μL (1U)，加無(wú)RNA酶水至總?cè)莘e為25 μL。震蕩混勻放入定量PCR儀中，設(shè)置循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃后延伸10 min，-20 ℃保存。將制好的1.5%瓊脂糖凝膠置于電泳槽中，注入Tris-乙酸電泳液(稍高于凝膠層)。cDNA產(chǎn)物和6×上樣緩沖液按5∶1混合后加入加樣孔中，另加DNA marker。接通電流恒壓電泳30 min。采用美國(guó)Gene Genius凝膠電泳成像系統(tǒng)測(cè)出目的基因和gapdh的表達(dá)強(qiáng)度，以同一標(biāo)本的gapdh的產(chǎn)物積分光密度校正各自的目的基因的積分光密度值，并按公式相對(duì)值=目的基因表達(dá)強(qiáng)度/gapdh表達(dá)強(qiáng)度計(jì)算出相對(duì)值。

2 結(jié) 果

各組小鼠肺組織PPAR-γ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及PPAR-γmRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表1、圖1。

組 別nPPAR-γ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mm2)PPAR-γmRNA表達(dá)正常對(duì)照組106．21±0．300．12±0．03模型組1010．30±0．66?0．39±0．02?地塞米松組107．32±0．46?△0．24±0．06?△射干麻黃湯組1011．95±0．40?△#0．39±0．03?△#射干麻黃湯加味組1012．57±0．45?△#○0．55±0．06?△#

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與地塞米松組比較，#P<0.05；與射干麻黃湯組比較，○P<0.05

圖1 各組小鼠肺組織PPAR-γmRNA表達(dá)

A為正常對(duì)照組，B為模型組，C為地塞米松組，D為射干麻黃湯組，E為射干麻黃湯加味組

由表1、圖1可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型組、地塞米松組、射干麻黃湯組及射干麻黃湯加味組小鼠肺組織PPAR-γ數(shù)量及PPAR-γmRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組PPAR-γ數(shù)量及PPAR-γmRNA表達(dá)明顯減少(P<0.05)，射干麻黃湯組及射干麻黃湯加味組PPAR-γ數(shù)量及PPAR-γmRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與射干麻黃湯組比較，射干麻黃湯加味組PPAR-γ數(shù)量及PPAR-γmRNA表達(dá)明顯增加 (P<0.05)。

3 討 論

射干麻黃湯是治療冷哮的常用傳統(tǒng)方劑。研究證實(shí)，該方可減輕氣道炎癥，降低氣道高反應(yīng)性[2]，并能延緩氣道重塑進(jìn)程[3]，無(wú)論對(duì)于一般的哮喘發(fā)作[4]還是咳嗽變異性哮喘[5]均具有較好的效果，為增加療效其臨床多靈活加減治療。我們通過(guò)臨床反復(fù)篩選優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，本研究中的射干麻黃湯加味效果頗佳。射干麻黃湯加味是在射干麻黃湯的基礎(chǔ)上加芥子、地龍而成。芥子性味辛，溫，入肺、胃經(jīng)，利氣豁痰，溫中散寒，通絡(luò)止痛，可治痰飲咳喘、胸脅脹滿(mǎn)疼痛、反胃嘔吐等。孫思邈載其“治咳嗽胸脅支滿(mǎn)，上氣多唾者，每日溫酒吞下七?！??！夺t(yī)學(xué)入門(mén)》中言及“利胸膈痰，止翻胃吐食，痰嗽上氣”。地龍性寒，味咸，可清熱、止喘、通絡(luò)，歸肝、胃、肺、膀胱經(jīng)，功能清熱平肝、熄風(fēng)止痙、平喘、利尿、通絡(luò)除痹?，F(xiàn)代藥理研究表明，地龍?zhí)崛∫壕哂辛己玫亩绕酱饔肹6]。我們?cè)谥委熇湎臏責(zé)崴幬镏屑尤胄┝亢疀鏊幬?，即可防熱藥辛散太過(guò)，又可加強(qiáng)平喘之效。

PPAR-γ參與調(diào)控哮喘多種炎癥細(xì)胞的功能及炎癥基因的轉(zhuǎn)錄，作用機(jī)制復(fù)雜[7-9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察射干麻黃湯加味對(duì)慢性哮喘小鼠肺組織PPAR-γ表達(dá)的影響，探討其治療哮喘的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哮喘組肺泡區(qū)有大量的PPAR-γ陽(yáng)性細(xì)胞(P<0.05)，PPAR-γmRNA表達(dá)強(qiáng)度明顯增加(P<0.05)。地塞米松能明顯下調(diào)肺組織PPAR-γ數(shù)量及PPAR-γmRNA表達(dá)(P<0.05)，但不能有效抑制氣道炎癥。而射干麻黃湯及其加味均可增強(qiáng)肺組織PPAR-γ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及PPAR-γmRNA的表達(dá)(P<0.05)。提示射干麻黃湯及其加味與地塞米松的作用機(jī)制不同。我們分析，哮喘時(shí)PPAR-γ的數(shù)量、轉(zhuǎn)錄是對(duì)氣道內(nèi)炎癥反應(yīng)的應(yīng)答，目的在于阻止炎性細(xì)胞的激活，在使用射干麻黃湯及其加味后PPAR-γ的數(shù)量、轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，從而調(diào)動(dòng)了其阻止炎性細(xì)胞激活功能，最終也達(dá)到了抑制氣道炎癥的抗炎效果。

綜上所述，射干麻黃湯加味可抑制BALB/c哮喘小鼠哮喘的發(fā)生，其機(jī)制有可能是通過(guò)升高PPAR-γ的數(shù)量及轉(zhuǎn)錄表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，射干麻黃湯加味對(duì)PPAR-γ的數(shù)量、轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響大于射干麻黃湯組，從側(cè)面也證實(shí)了中醫(yī)辨證論治理論的正確性。

[1] 魏倩，梁紅亮，王昌明，等.PPARγ在慢性免疫性炎癥疾病中的作用[J].西南國(guó)防醫(yī)藥，2010，20(11)：1268-1270.

[2] Ueki S，Adachi T，Bourdeaux J，et al.Expression of PPARγin eosinophils and its functional role in survival and chemotaxis[J].Immunollett，2003，86(2)：183-189.

[3] Woerly G，Honda K，Loyens M，et al.Peroxisome proliferators-activated receptors alpha and gamma down-regulate allergic inflammation and eosinophil activation[J].J Exp Med，2003，198(3)：411-421.

[4] Angeli V，Hammad H，Staels B.Peroxisome proliferators-activated receptorγinhibits the migration of dendritic cells：consequences for the immune response[J].J Immunol，2003，170(10)：5295-5301.

[5] 林永廉，林求誠(chéng).射干麻黃湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性哮喘豚鼠嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的影響[J].實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2007，23(1)：3-5.

[6] 林建海，劉寶裕.平喘中藥對(duì)致敏性喘豚鼠氣道的作用[J].上海醫(yī)學(xué)，1996，19(11)：638-641．

[7] 劉鑫，鄒中蘭，梅全慧，等.射干麻黃湯對(duì)慢性哮喘大鼠缺氧誘導(dǎo)因子-1α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)及氣道重塑的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(8)：190-195.

[8] 張玉龍.射干麻黃湯加味治療支氣管哮喘發(fā)作期67例[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，34(4)：58-59.

[9] 王紅珊，李國(guó)豪，曹毅敏，等.射干麻黃湯聯(lián)合孟魯司特治療咳嗽變異型哮喘86例[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(15)：273-275.

(本文編輯：曹志娟)

StudyofSheganMahuangdecoctionontheexpressionofperoxisomeproliferator-activatedreceptorγinlungtissueofAsthmaticmice

ZHANGLi,ZHAOHui,JIHui,etal.

PulmonaryDiseaseDepartment,CangzhouHospitalsofTraditionalChineseandWesternmedicine,Hebei,Cangzhou061001

ObjectiveTo explore the effect of Shegan Mahuang decoction on the expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPAR-γ) in lung tissue of Asthmatic mice.Methods50 healthy clean female BALB / c mice were randomly divided into normal control group, model group, Dexamethasone group, Shegan Mahuang decoction group and improved Shegan Mahuang decoction group, 10 mice in each group.After establishing a mouse model of chronic asthma, corresponding to each drug group were drug intervention, the normal control group and model group were 0.9% sodium chloride injection by intraperitoneal injection.After four consecutive weeks mice lung tissue of each group were taken, the number and the expression transcription of PPAR-γ in mouse lung tissue were detected using immunohistochemical staining (SP), RT-PCR technique.ResultsThe number and the expression transcription of PPAR-γ in mouse lung tissue in model group were increased as compared with those in normal control group (P<0.05).The number and the expression transcription of PPAR-γ were decreased after treatment of Dexamethasone (P<0.05).Those in Shegan Mahuang decoction group and improved Shegan Mahuang decoction group were increased (P<0.05).The increase in improved Shegan Mahuang decoction group was obvious (P<0.05).ConclusionShegan Mahuang decoction can inhibit incidence of asthma in BALB / c mice with asthma, the mechanism may be achieved by increasing the number of PPAR-γ expression and transcription.

Asthma; Disease models; Animal; Experiments; Mouse; Sheganmahuang decoction; Meson; Earthworm; Peroxisome proliferator-activated receptor

※ 項(xiàng)目來(lái)源：河北省中醫(yī)藥管理局2011年度中醫(yī)藥類(lèi)科研計(jì)劃課題(編號(hào)：2011161)

張麗(1981—)，女，主治醫(yī)師，博士。從事呼吸科臨床工作。研究方向：呼吸系統(tǒng)各種常見(jiàn)病、疑難病的中西醫(yī)結(jié)合綜合治療。

R562.250.5；R289.5；R285.5

A

1002-2619(2014)06-0895-03

2013-07-15)