趙春梅

(河北省保定市第二中心醫(yī)院, 河北 保定, 072750)

卵巢上皮癌(EOC)是最常見的婦科惡性腫瘤之一[1]，其常規(guī)治療手段包括原位切除及術(shù)后放化療。盡管許多患者在常規(guī)治療后，其腹水癥狀可得到緩解，但大多數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)情況，因而目前EOC逐漸成為致死率最高的婦科腫瘤之一。許多研究[2]證實(shí)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)能夠下調(diào)非特異性免疫水平，促進(jìn)腫瘤發(fā)展，對(duì)于患者的治療和康復(fù)有不良影響。有研究[3]認(rèn)為FoxP3+ Tregs對(duì)于EOC的預(yù)后有影響，但大多相關(guān)研究是通過病理切片或?qū)嶒?yàn)進(jìn)行研究，缺乏臨床研究，目前只明確在部分EOC病理過程中可能發(fā)生卵巢Tregs原位積累[4]，但有關(guān)外周血Tregs與EOC的關(guān)系則并未明晰。本研究選取2010年1月—2013年6月本院收治的卵巢癌患者50例，對(duì)比治療前后外周血Tregs水平，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月—2013年6月本院收治的卵巢癌患者50例，平均年齡(55.7+7.33)歲，均經(jīng)影像學(xué)檢查及病理活檢確診為EOC，癌癥分期根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2002年修訂的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ、Ⅱ期患者24例為Z組，Ⅲ、Ⅳ期患者26例W組。所有患者術(shù)前均無免疫抑制劑使用、圍術(shù)期輸血史、自身免疫性疾病、6個(gè)月內(nèi)未接受抗腫瘤化療及免疫調(diào)節(jié)治療。所有患者均知情且同意接受術(shù)后外周血Tregs檢測。

1.2 治療方法

所有患者均因故不能接受手術(shù)治療，并接受聯(lián)合化療：阿霉素40～50 mg/kg與環(huán)磷酰胺500 mg/kg, 靜注后間隔4周為一個(gè)療程。血液樣本采集患者治療前及治療6個(gè)療程后清晨空腹外周靜脈血，樣本含量均為5 mL, 經(jīng)抗凝處理后即行檢驗(yàn)。人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測試劑盒(Human Regulatory T cell Staining Kit)購自美國ebioscience公司，檢測用流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司，型號(hào)為MoFlo XDP。對(duì)所得血液樣本按照生產(chǎn)商提供的步驟進(jìn)行預(yù)處理后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，具體步驟如下：取抗凝混勻的全血100 μL加入流式上樣管，分別加入抗cD4-FITC 10 μL和抗CD25-PE 10 μL，室溫下孵育30 min, 后裂解紅細(xì)胞。向上樣管內(nèi)加入破膜/固定劑1 mL, 4 ℃避光孵育40 min。洗滌細(xì)胞后加入鼠血清4 ℃避光15 min, 加入抗Foxp3-PE～Cy5及IgG2a-PE-Cy5同型對(duì)照, 4 ℃避光孵育30 min, 洗滌后多聚甲醛重懸細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測并分析。記錄外周血Tregs占CD4+T細(xì)胞的比例。治療后隨訪6個(gè)月，記錄患者復(fù)發(fā)情況并進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

聯(lián)合化療6個(gè)療程后，臨床控制率100%。測得Z組患者治療前外周血Tregs表達(dá)頻數(shù)平均數(shù)為(17.32±7.68)%, 明顯低于W組的治療前頻數(shù)平均數(shù)(25.67±11.05)%(P<0.05), 治療后Z組依然明顯低于W組(P<0.05), 且2組治療前后外周血Tregs表達(dá)頻數(shù)平均數(shù)均呈現(xiàn)治療后較治療前明顯降低的趨勢(P<0.05)。治療后半年內(nèi)Z組復(fù)發(fā)7例，W組復(fù)發(fā)17例，Z組復(fù)發(fā)率明顯低于W組(χ2=6.56,P<0.05)。見表1。

表1 2組患者外周血Tregs表達(dá)頻數(shù)比較

3 討 論

EOC是世界范圍內(nèi)女性致死率第五位的惡性腫瘤，其早期癥狀不明顯及高復(fù)發(fā)率是導(dǎo)致這一結(jié)果的主要原因[1]。一般認(rèn)為EOC的發(fā)生來源于外部致癌物質(zhì)以及體內(nèi)激素調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂。然而隨著對(duì)EOC認(rèn)識(shí)的深入，人們逐漸意識(shí)到腫瘤微環(huán)境對(duì)于EOC各期的發(fā)生和發(fā)展有重要影響，其中免疫系統(tǒng)對(duì)于EOC的影響尤為突出[5]。無論是原發(fā)還是復(fù)發(fā)EOC，均可發(fā)現(xiàn)免疫促進(jìn)體系與免疫抑制體系間的微妙平衡對(duì)腫瘤生長起重要作用[6]。生理情況下卵巢、子宮及附件組織間隙內(nèi)存在著數(shù)量可觀的CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞，這些細(xì)胞構(gòu)成的非特異性免疫微環(huán)境被認(rèn)為是影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，且有跡象表明其受到外周血Tregs的調(diào)控[7-9]。Tregs是一類表達(dá)IL-2受體α鏈的活化T細(xì)胞的集合，這類細(xì)胞在自體免疫抑制和外周耐受中起主要作用，由于CD4+/CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是這類細(xì)胞中發(fā)揮重要作用者和主要研究對(duì)象，因而作為一般研究對(duì)象即將其定義為Tregs[10]。由于其對(duì)于T細(xì)胞的發(fā)育和功能具有關(guān)鍵作用，而非特異性免疫在腫瘤免疫抑制的建立與維持過程中具有重要作用，因而Tregs與腫瘤的關(guān)系也成了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。Tregs介導(dǎo)的免疫抑制是腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的主要機(jī)制和針對(duì)腫瘤免疫治療失敗的主要原因[11-13]。Tregs在EOC中的作用較健康人的功能有所不同，有報(bào)道[14]稱正常情況下Tregs在無血清培養(yǎng)基中無法抑制CD4+、CD25+T細(xì)胞，而EOC患者Tregs則可以抑制，因而在EOC中Tregs的免疫抑制性可能得到了增強(qiáng)。另有研究[15]表明Tregs能夠抑制T細(xì)胞應(yīng)對(duì)Tregs抑制的敏感性及應(yīng)激能力。越來越多的研究[16-17]表明, Tregs能夠影響侵及器官內(nèi)包括非特異性免疫和特異性免疫在內(nèi)的整個(gè)腫瘤微環(huán)境，使得器官內(nèi)免疫耐受增強(qiáng)，使得體內(nèi)腫瘤相關(guān)免疫功能受到抑制，這一變化可能為EOC的發(fā)生創(chuàng)造有利條件。因而，外周血Tregs的表達(dá)水平可能直接反映EOC的病理進(jìn)程，其可作為評(píng)估EOC病情及預(yù)后的重要標(biāo)志物。本研究通過臨床研究部分證實(shí)了上述假設(shè)，通過比較治療前后外周血Tregs表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，病情處于較為初期的Ⅰ、Ⅱ期患者，其外周血Tregs表達(dá)水平明顯低于中末期的Ⅲ、Ⅳ期患者，這說明外周血Tregs表達(dá)水平在一定程度上隨EOC病情發(fā)展升高，證實(shí)了之前報(bào)道所稱EOC發(fā)生發(fā)展與Tregs的密切關(guān)系，也進(jìn)一步理清了其相關(guān)關(guān)系。通過治療, 2組患者病情均得到臨床控制，但其外周血Tregs表達(dá)水平依然存在與治療前相似的關(guān)系，這說明外周血Tregs表達(dá)水平可以反映更深層次的病理情況，即便均得到臨床控制，但Z組患者外周血Tregs表達(dá)水平低于W組患者，說明其病情仍有差異。這一差異在隨訪過程中復(fù)發(fā)情況得到了部分反映，治療結(jié)束后6個(gè)月內(nèi)，Z組患者復(fù)發(fā)率明顯低于W組患者，這說明外周血Tregs表達(dá)水平與EOC復(fù)發(fā)具有密切相關(guān)性。有報(bào)道[18-20]稱在子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、直結(jié)腸癌等病例中也觀察到相似情況，但目前對(duì)于這一相關(guān)性的具體機(jī)制尚不明晰。

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