肖 虹

(重慶市急救醫(yī)療中心 神經(jīng)外科, 重慶, 400014)

作者以前的研究表明光敏劑ALA誘導(dǎo)的光化學(xué)反應(yīng)有抗腫瘤活性。自噬(也稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡)和Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡共享一些監(jiān)管因素和相互參與腫瘤發(fā)生[1-3]。自噬活性與腫瘤的分化狀態(tài)相關(guān)，惡變通常發(fā)生自噬活性的抑制。有研究[4]發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞的各種抗腫瘤劑的作用涉及到自噬性細(xì)胞死亡。光動(dòng)力療法(PDT)是被批準(zhǔn)用于治療癌性疾病和非腫瘤性疾病的微創(chuàng)治療方法。本研究探討自噬和凋亡在ALA- PDT誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡中的聯(lián)合作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和ALA- PDT

C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞由西南醫(yī)院病理研究所提供。細(xì)胞培養(yǎng)在在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(37 ℃, 5% CO2溫育)。C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于6孔板中，并培養(yǎng)24 h, ALA(100, 200, 400, 800, 1 600 μg/mL)的溶液中加入到培養(yǎng)基中和PDT(波長為635 nm, 200 W/cm2的強(qiáng)度及5 min的照射時(shí)間)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記(monodansylcardeverine)(MDC)或固定電鏡檢查。C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞(用400 μg/mL的ALA-PDT 1～24 h)收獲提取總蛋白，以確定胱天蛋白酶活化對(duì)ALA-PDT誘導(dǎo)的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡的機(jī)制。

1.2 檢測(cè)細(xì)胞自噬MDC熒光染色

檢測(cè)autophagicvacuoles(AV)的是基于Biederbick等[5]的方法進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)物被卸載并用PBS沖洗2次，以除去含血清培養(yǎng)基中。然后，經(jīng)過孵育的MDC在0.05 mmol/L, 在37 ℃ 60 min, 將細(xì)胞浸泡在4%多聚甲醛中15 min后，用PBS沖洗2次，并在露天干燥。最后，將細(xì)胞通過使用熒光顯微鏡與356 nm的發(fā)射濾片和545 nm處擊穿過濾盤進(jìn)行觀察和拍照。

1.3 透射電子顯微鏡檢查

將細(xì)胞固定于冰冷的2.5%戊二醛的0.1 M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，并于4 ℃中進(jìn)一步的處理保持不變。當(dāng)處理重新開始，細(xì)胞后固定在1%四氧化鋨在同一緩沖液中，脫水，分級(jí)醇，切片用超薄切片機(jī)，蘸上醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛后接著用透射電子顯微鏡檢查。

1.4 Western印跡

C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞行ALA-PDT (波長為635 nm, 200 W/cm2的強(qiáng)度及5 min射時(shí)間)培養(yǎng)在6孔培養(yǎng)板中與ALA(400 μg/mL)處理后，對(duì)細(xì)胞貼壁和浮收集細(xì)胞，冷凍在-80 ℃ 。將細(xì)胞沉淀物重新懸浮按照Western Blotting方法凝膠成像顯影分析結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0數(shù)據(jù)處理軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ALA-PDT誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬活化現(xiàn)象的觀察

本實(shí)驗(yàn)中所使用的MDC是一種特異性自噬標(biāo)記物，它可被細(xì)胞吸收并選擇性地聚集于自噬囊泡(AVs)中，用熒光顯微鏡可觀察到染上MDC熒光的AVs呈點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，散布于胞漿及核周，因此可根據(jù)細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒的變化來形象地檢測(cè)推斷自噬的活化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ALA-PDT(400 μg/mL)3 h后，即可見明顯的點(diǎn)狀熒光顆粒散布于C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)，照射后6、12 h處理組熒光顆粒更加明顯，照射后24 h熒光顆粒變得很弱，而對(duì)照組很少有熒光顆粒的分布。提示400 μg/mL的ALA-PDT 3 h后即有大量自噬囊泡出現(xiàn)，并持續(xù)至照射24 h。表明PDT后3 h可誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，形成自噬囊泡; PDT后6～12 h, 細(xì)胞內(nèi)自噬大量活化，自噬囊泡數(shù)目增多。對(duì)照組無明顯自噬現(xiàn)象出現(xiàn)。見圖1。

圖1 MDC自噬特異染色觀察ALA-PDT后3h C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬泡的變化情況 左圖為普通光源;右圖為熒光

2.2 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

由于透射電鏡可形象地觀察到獨(dú)立雙層膜、自噬體等自噬過程中各形態(tài)的變化，直至今日，電鏡仍是國內(nèi)外普遍認(rèn)可的最為可靠的自噬檢測(cè)手段。本實(shí)驗(yàn)在ALA-PDT后各時(shí)間點(diǎn)制作成普通電鏡標(biāo)本，透射電鏡下觀察C6細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變：陰性對(duì)照組C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)細(xì)胞核、各細(xì)胞器、染色體形態(tài)和分布均正常。而ALA-PDT(400 μg/mL)后3 h, 胞漿中即出現(xiàn)大量獨(dú)立雙層膜結(jié)構(gòu)，甚至彎曲呈同心圓，部分區(qū)域形成大量雙層及多層膜結(jié)構(gòu)的自噬體(圖2 A、B)。ALA-PDT 12～24 h, 透射電鏡下可以觀察到大部分細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡樣改變：細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞膜表面微絨毛消失，胞漿濃縮、染色深，胞漿內(nèi)可見細(xì)胞器空泡樣變及由線粒體退行性變形成的髓鞘結(jié)構(gòu)，胞核縮小，染色質(zhì)邊聚，有些呈現(xiàn)新月形改變，細(xì)胞膜上有大小不等的突起，凋亡小體形成等(圖2C); 同時(shí)胞質(zhì)內(nèi)一些溶酶體染色加深，出現(xiàn)了大量自噬溶酶體(圖2D)。

圖2 ALA-PDT后6 h C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

2.3 ALA-PDT對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞溶酶體酶Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

PDT后1 h C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)即有少量Caspase-3被活化，之后活性片段的水平降低，照射12 h后活性片段最多，此時(shí)Caspase-3酶原表達(dá)也增高。若在ALA-PDT前30 min加入Caspase-3特異抑制劑Ac-DEVD-CHO，則可見活化Caspase-3酶原活化明顯減弱, 與ALA-PDT組比較具有顯著性差異(P<0.05)。見圖3-4。

3 討 論

與Pro-caspase-3組比較，*P<0.05

PDT是一種有較高特異性的治療惡性腫瘤方法，PDT后腫瘤細(xì)胞的死亡途徑及其機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。光敏劑的種類及光敏劑在細(xì)胞內(nèi)部的亞分布等都是影響腫瘤細(xì)胞死亡途徑的因素[6]。近年來，自噬與惡性膠質(zhì)瘤的關(guān)系逐漸被人們重視，臨床的研究也證實(shí)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)促凋亡的放化療藥物明顯耐受，而對(duì)促自噬作用的藥物如替莫唑胺卻很敏感，可見自噬與惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。作者實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ALA-PDT可誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生。但自噬對(duì)促進(jìn)腫瘤和抑制腫瘤均有作用，Jia等[7]認(rèn)為自噬的早期階段是某些細(xì)胞發(fā)生凋亡所必需的。自噬抑制劑3-MA預(yù)處理阻斷自噬后, C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生存率在PDT早期(1～3 h)顯著降低，后期下降不明顯，表明自噬在ALA-PDT照射早期對(duì)受損細(xì)胞器(如溶酶體等)及時(shí)隔離、清除具有一定作用，若阻斷自噬將去除細(xì)胞的自我保護(hù)作用，細(xì)胞存活率減少。結(jié)合PDT后12 h電鏡下所見大量細(xì)胞空泡化，可推斷隨著胞內(nèi)細(xì)胞器的進(jìn)一步損傷，促凋亡因子的大量釋放以及死亡信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的放大，細(xì)胞的破壞程度超過了自噬的保護(hù)能力，自噬性程序性細(xì)胞死亡被啟動(dòng)，并與凋亡共同促進(jìn)細(xì)胞走向滅亡。由此可見，自噬對(duì)PDT后C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的保護(hù)作用僅體現(xiàn)為延遲細(xì)胞死亡的發(fā)生，最終是與凋亡發(fā)生協(xié)同作用促進(jìn)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡，起到ALA-PDT的殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)。C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞在ALA-PDT后誘導(dǎo)自噬與凋亡發(fā)生，二者可能同時(shí)受到某一中心細(xì)胞器的調(diào)控，處于動(dòng)態(tài)變化之中。例如溶酶體可以作為整合和傳達(dá)各種信號(hào)、聯(lián)系和激活自噬與凋亡途徑的紐帶[8]。自噬發(fā)生到最終階段，自噬體的外層膜可與溶酶體膜發(fā)生融合，從而釋放內(nèi)層膜囊泡即自噬小體進(jìn)入溶酶體內(nèi)發(fā)生降解。MDC染色、電鏡結(jié)果已顯示，自噬參與了ALA-PDT誘導(dǎo)的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的死亡過程，而細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶的活性極有可能與之有關(guān)。自噬與凋亡在溶酶體的整合調(diào)控下處于動(dòng)態(tài)變化之中，兩者在細(xì)胞死亡中所起的作用受信號(hào)傳導(dǎo)通路中某些關(guān)鍵因子的影響[9]。在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中, ALA-PDT導(dǎo)致自噬泡形成后Caspase酶原的大量釋放誘導(dǎo)了自噬和凋亡發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中Caspase 3在ALA-PDT后即開始表達(dá)增加，用自噬抑制劑3MA和Ac-DEVD-CHO干擾后表達(dá)量均有所下降，結(jié)合在用MDC對(duì)AVs進(jìn)行熒光染色的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞在PDT后1 h未見明顯包含自噬泡的熒光顆粒出現(xiàn)[10-12]; 電鏡下觀察，凋亡形態(tài)的出現(xiàn)(照射后6 h)晚于自噬的活化(照射3 h)的情況，說明自噬在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞損傷的早期及時(shí)清除受損細(xì)胞器，可能抑制Caspase活化途徑，在一定程度上延遲甚至拮抗了凋亡；但自噬在細(xì)胞死亡中扮演的角色并不是一成不變的，如果胞內(nèi)細(xì)胞器進(jìn)一步遭到破壞以及促凋亡因子的大量釋放超過了自噬的承受范圍，自噬轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞死亡誘因，自噬性死亡、凋亡甚至壞死將共同促進(jìn)細(xì)胞走向滅亡。ALA-PDT后1 h, C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Caspase-3輕度活化，照射后12 h的Caspase-3大量活化，且酶原表達(dá)增高;而用Ac-DEVD-CHO預(yù)先處理時(shí)，Caspase-3的活化明顯減弱[13-14]。自噬與凋亡所處地位不同，由于C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中完整的Caspase級(jí)聯(lián)放大體系，使得凋亡在細(xì)胞死亡中處于主導(dǎo)地位，自噬誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用被掩蓋，而其保護(hù)細(xì)胞的功能顯現(xiàn)出來。

與Actived-caspase-3組比較，*P<0.05

綜上所述，細(xì)胞內(nèi)各種死亡途徑并不是獨(dú)立存在的，而是在某些關(guān)鍵環(huán)節(jié)由一些中心因子共同調(diào)控著。目前對(duì)自噬與凋亡之間的關(guān)系還不清楚，但已肯定兩者間的相互獨(dú)立是相對(duì)的，相互聯(lián)系是絕對(duì)的。自噬與凋亡是ALA-PDT作用下C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)自噬體大量形成、溶酶體酶大量釋放及Caspase級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)的結(jié)果。ALA-PDT早期，自噬延遲了Caspase依賴的凋亡發(fā)生，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有保護(hù)作用。但有研究證實(shí)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)促凋亡機(jī)制耐受，但卻對(duì)促自噬作用敏感，誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，可能是成功治療腦膠質(zhì)瘤的重要突破口[15-16]。如替莫唑胺作為目前臨床最有效的抗膠質(zhì)瘤藥就是通過破壞了以mTOR信號(hào)控制路徑促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬過程達(dá)到細(xì)胞毒性作用。隨著對(duì)各種抗癌治療機(jī)制研究的深入，對(duì)自噬與凋亡的相互關(guān)系及其分子機(jī)制，自噬在細(xì)胞死亡中角色的改變，自噬、溶酶體酶與Caspase依賴和非依賴的凋亡、程序性壞死之間相互作用的調(diào)控機(jī)制將得到進(jìn)一步的了解，人們可特異性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，為在腫瘤治療中提供新思路。

[1] Wang Y, Hu Z, Liu Z, et al. MTOR inhibition attenuates DNA damage and apoptosis through autophagy-mediated suppression of CREB1[J]. Autophagy, 2013,9(12):2069.

[2] Ghavami S, Shojaei S, Yeganeh B, et al. Autophagy and apoptosis dysfunction in neurodegenerative disorders[J]. Prog Neurobiol, 2014, 112: 24.

[3] Kumar D, Shankar S, Srivastava R K. Rottlerin induces autophagy and apoptosis in prostate cancer stem cells via PI3K/Akt/mTOR signaling pathway[J].Cancer Lett, 2014, 343(2): 179.

[4] K. Berg, P K. Selbo, A.. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications[J]. J. Microsc, 2005, 218: 133.

[5] Xing S, Zhang J, Dang C, et al. Cerebrolysin reduces amyloid-β deposits, apoptosis and autophagy in the thalamus and improves functional recovery after cortical infarction[J].J Neurol Sci, 2014, 337(1/2): 104.

[6] A. Rasola, P. Bernardi. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis[J]. Apoptosis, 12 (2007): 815.

[7] Sui X, Kong N, Ye L, et al. p38 and JNK MAPK pathways control the balance of apoptosis and autophagy?in response to chemotherapeutic agents[J].Cancer Lett, 2014, 344(2):174.

[8] G. Kroemer, L. Galluzzi, C. Brenner. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death[J]. Physiol. Rev, 2007,87: 99.

[9] Yazbeck V Y, Li C, Grandis J R, et al. Single-agent obatoclax (GX15-070) potently induces apoptosis and pro-survival autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells[J].Oral Oncol, 2014, 50(2): 120.

[10] 高鵬, 蔣樹財(cái), 郭暉, 等. 大鼠增殖抑制基因抑制大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及其機(jī)制[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 36(4): 381.

[11] 邵華明, 王穗暖, 李璐, 等. 乙酰肝素酶的mRNA表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤分級(jí)關(guān)系的研究[J]. 實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志, 2011, 15(15): 130.

[12] 邵云, 俞向榮, 吳一平, 等. 轉(zhuǎn)鐵蛋白與RGD共修飾脂質(zhì)體用于腦膠質(zhì)瘤靶向性研究[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 36(6): 592.

[13] 包婺安, 胡福軍. 尼妥珠單抗治療高分級(jí)膠質(zhì)瘤研究進(jìn)展[J]. 實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志, 2011, 15(23): 179.

[14] 閆廣寧, 楊浪, 崔有宏, 等. 內(nèi)皮細(xì)胞通過Hedgehog通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 36(8): 733.

[15] 尚偉, 劉安龍, 李保慶, 等. 大腦膠質(zhì)瘤病的磁共振及磁共振波譜診斷價(jià)值[J]. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2011, (5): 605.

[16] 周坤, 楊輝, 周偉, 等. 藥物阻斷mGlu3受體通路對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖與分化的影響[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 32(17): 170.