鄧秀君

骨髓源干細(xì)胞移植與中藥聯(lián)合治療對(duì)大鼠缺血再灌腦損傷的作用

鄧秀君

目的 比較中藥與骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMNC)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)蛛網(wǎng)膜下腔移植治療缺血腦卒中大鼠腦損傷的作用。方法 147只大鼠隨機(jī)分成七組, 為正常組、假手術(shù)組、模型組、BMNC組、中藥聯(lián)合BMNC組、BMSC組、中藥聯(lián)合BMSC組, 每組21只。除正常組和假手術(shù)組, 其余組分別移植BMSC和BMNC, 中藥組同時(shí)進(jìn)行中藥聯(lián)合治療。分別于移植后4、28 d評(píng)定鼠神經(jīng)功能損傷恢復(fù)情況。結(jié)果 治療28 d比治療后4 d MMNSS神經(jīng)功能評(píng)分低, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。結(jié)論 以相同劑量細(xì)胞移植, BMNC對(duì)神經(jīng)功能的修復(fù)作用更好, 中藥聯(lián)合BMNC移植對(duì)缺血性腦梗死神經(jīng)功能障礙的修復(fù)具有協(xié)同作用。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；骨髓單個(gè)核細(xì)胞; 中藥；大腦中動(dòng)脈梗死；蛛網(wǎng)膜下腔；細(xì)胞移植；神經(jīng)功能評(píng)分

目前缺血性腦血管病以高致殘率嚴(yán)重影響患者的生活,因此近年來腦血管病的研究多以尋找新的治療手段和干預(yù)策略為目標(biāo)。本研究比較中藥聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)、骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMNC) 治療缺血再灌注模型(MCAO)大鼠。應(yīng)用NSS神經(jīng)功能評(píng)價(jià)量表, 評(píng)定鼠神經(jīng)功能損傷后的恢復(fù)情況, 找到較適合的中西醫(yī)結(jié)合治療缺血再灌注的實(shí)驗(yàn)方案,探討缺血性腦血管病的生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Wistar大鼠SPF/VAF級(jí)雄性(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司), 共計(jì)157只。3～4月齡,體重(270±20)g, 147只；3～4周齡, 體重70～90 g, 10只。主要試劑：胎牛血清、培養(yǎng)基L-DMEM、0.25%胰酶(均源于美國(guó)GIBCO公司)；5’-溴脫氧核苷尿嘧啶(武漢博士德公司)；0.9%生理鹽水(沈陽(yáng)北方制藥廠)大鼠淋巴細(xì)胞分離液(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所)；蝮龍抗栓丸(第二中醫(yī)醫(yī)院)主要成分為天麻、菖蒲、黃芪、丹參、川芎、蝮蛇等。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物的分組及干預(yù) 將3～4月齡的Wistar雄性大鼠, 147只, 隨機(jī)分成七組, 每組21只。分為正常組、假手術(shù)組、模型組、BMNC組、中藥聯(lián)合BMNC組、BMSC組、中藥聯(lián)合BMSC組。術(shù)后24 h正常組不移植, 假手術(shù)組和模型組蛛網(wǎng)膜下腔注射0.1MPBS, 其他組蛛網(wǎng)膜下腔細(xì)胞移植(2×107個(gè)),中藥組灌胃1次/d, 直至4、28 d取材。147只實(shí)驗(yàn)大鼠, 造模手術(shù)死亡10只, 評(píng)分不符合剔除11只, 灌胃死亡3只,足趾損傷4只, 最終納入119只, 平均每組17只。

1.2.2 大鼠模型建立 利用Zea Longa改良線栓法［1］, 建立大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞2 hMCAO。Wistar大鼠, 3～4月齡, 腹腔麻醉。鈍性分離暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA), 頸外動(dòng)脈(ECA),頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA), 結(jié)扎CCA, 在根部結(jié)扎ECA, 在CCA近頸內(nèi)、頸外分叉處剪一小口, 將長(zhǎng)度約為4 cm末端燒圓的尼龍線送入ICA內(nèi), 深度約為(18±2)mm, 結(jié)扎ICA, 堵塞MCA起始端血流。2 h后, 抽出尼龍線, 恢復(fù)灌注。麻醉蘇醒后, mNSS評(píng)分在6分以上的大鼠為造模成功, 其余剔除。正常組不處理。假手術(shù)組大鼠操作至暴露ICA、ECA后簡(jiǎn)單剝離即縫合,其余處理同手術(shù)組。

1.2.3 干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及移植 Wistar雄性大鼠, 3～4周齡, 腹腔麻醉, 取脛骨、股骨。剪開兩端, 用4℃PBS反復(fù)沖洗骨髓。離心, 收集單個(gè)核細(xì)胞層。用含10%胎牛血清L-DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。24 h后換培養(yǎng)液, 每3天換液1次。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%時(shí), 用胰蛋白酶消化備用。

將培養(yǎng)的BMSCs或BMNCs 細(xì)胞制成細(xì)胞懸液, 在MCAO模型鼠的枕骨大孔處, 以1 μl/min進(jìn)行蛛網(wǎng)膜下腔移植, 細(xì)胞總數(shù)約為2×107個(gè), 體積100 μl。模型組以0.01 MPBS代替。

1.2.4 大鼠神經(jīng)功能的評(píng)定 治療4、28 d對(duì)各組大鼠進(jìn)行評(píng)分, 評(píng)價(jià)神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

術(shù)后, 大鼠狀態(tài)較差, 體重下降明顯, 3～7 d后逐漸恢復(fù)。以模型組表現(xiàn)較典型, 各治療組大鼠恢復(fù)較快。與治療后4 d相比, 模型組和各治療組在28 d評(píng)分比較, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。評(píng)分見表1。注：與模型組相比,aP＜0.05 ；與BMNC組相比,bP＜0.05；與BMSC組相比,cP＜0.05；與4 d對(duì)應(yīng)組相比,dP＜0.05

表1 治療后4、28 d各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分( x-±s, 分)

3 討論

3.1 骨髓源干細(xì)胞移植治療腦血管病的作用機(jī)制 干細(xì)胞對(duì)腦梗死治療的作用機(jī)制是干細(xì)胞研究重要環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)表明BMSCs治療腦梗死的作用機(jī)制眾多, 目前尚未達(dá)成共識(shí)。一般認(rèn)為其治療效果的發(fā)揮是多途徑的, 且隨移植時(shí)間、空間和途徑的不同而變化。如腦梗死急性期移植主要通過神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)保護(hù)、抗炎和免疫抑制作用而發(fā)揮其療效, 而慢性期移植則通過血管和神經(jīng)組織重建而起作用。

3.2 細(xì)胞移植途徑 蛛網(wǎng)膜下腔通過腦脊液與腦室、循環(huán)系統(tǒng)相連。經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植, 可將細(xì)胞直接送入腦脊液內(nèi),到達(dá)病變部位。沒有血腦屏障的阻礙, 移植的細(xì)胞能最大限度發(fā)揮作用。較腦立體定位注射、介入移植的風(fēng)險(xiǎn)低, 存活率高。但大鼠試驗(yàn)移植難度較大, 為防大鼠因顱內(nèi)壓增高死亡, 應(yīng)準(zhǔn)確掌握進(jìn)針角度、速度, 移植的劑量等。

3.3 中藥復(fù)方聯(lián)合骨髓干細(xì)胞移植對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能修復(fù)的影響 缺血性腦梗死屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇, 以氣虛血瘀、風(fēng)火夾痰、濁夾瘀、痹阻脈絡(luò)為主要病機(jī)。中藥復(fù)方蝮龍抗栓丸以“益氣活血、熄風(fēng)化痰、化瘀通絡(luò)”為治法, 對(duì)缺血性中風(fēng)發(fā)揮作用［2］。

中藥對(duì)BMSC的影響為促進(jìn)BMSCs的生長(zhǎng)、增殖、分化等多個(gè)環(huán)節(jié)。近年來漸有中醫(yī)藥在BMSC移植治療腦缺血損傷影響方面的報(bào)道, 但多集中于對(duì)其體外誘導(dǎo)分化, 藥物以單味中藥或提取物為主, 而中藥復(fù)方的研究少見。中藥對(duì)移植后微環(huán)境的調(diào)控對(duì)MSCS存活、遷移、分化［3］, 及神經(jīng)組織恢復(fù)有重要意義。

以相同劑量移植, BMNC對(duì)神經(jīng)功能的修復(fù)作用較好；BMNC與中藥聯(lián)合治療缺血性腦梗死大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)情況最好, 中藥對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)具有協(xié)同作用。

［1］ Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke, 1989, 20(1):84-91.

［2］ 池明宇.血栓病中醫(yī)藥治驗(yàn).沈陽(yáng)：沈陽(yáng)出版社, 1998:17-26.

［3］ 杜少輝, 陳東風(fēng), 李伊為, 等.龜板對(duì)腦缺血大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元的影響.中華醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 85(3): 205-207.

2014-08-13］

110101 沈陽(yáng)市第二中醫(yī)醫(yī)院