王艷彬，吳海峰(.河北省血液中心檢驗(yàn)科，河北 石家莊 05006；2.河北省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 05004)

·論著·

非結(jié)核分枝桿菌2種培養(yǎng)方法和藥物敏感性試驗(yàn)研究

王艷彬1，吳海峰2*
(1.河北省血液中心檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050061；2.河北省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050041)

目的探討B(tài)ACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)法和CLSI M24-A微量肉湯稀釋法快速藥敏試驗(yàn)對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的意義。方法分別采用BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)法聯(lián)合微量肉湯稀釋法的快速藥敏試驗(yàn)與L-J固體培養(yǎng)法和絕對(duì)濃度藥敏法對(duì)48株非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)2種方法的培養(yǎng)時(shí)間和藥敏報(bào)告時(shí)間進(jìn)行比較。結(jié)果48株非結(jié)核分枝桿菌在BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀的平均陽(yáng)性報(bào)告時(shí)間(7.0±5.3)d，L-J培養(yǎng)基平均陽(yáng)性報(bào)告時(shí)間(17.5±10.2)d，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。微量肉湯稀釋法結(jié)果陽(yáng)性報(bào)告時(shí)間為7～14d，L-J固體藥敏試驗(yàn)陽(yáng)性報(bào)告時(shí)間為28d，2種藥敏試驗(yàn)方法對(duì)相同種類藥物的耐藥率分析結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，微量肉湯稀釋法比L-J法可以檢測(cè)的藥物種類更多。結(jié)論BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)法聯(lián)合微量肉湯稀釋法快速藥敏試驗(yàn)比L-J固體培養(yǎng)法和絕對(duì)濃度藥敏法在培養(yǎng)時(shí)間、藥敏結(jié)果種類和報(bào)告時(shí)間上優(yōu)勢(shì)明顯。

非結(jié)核分枝桿菌；微生物敏感性試驗(yàn)；細(xì)菌學(xué)技術(shù)

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.07.020

分枝桿菌屬除了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌外統(tǒng)稱為非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculousmycobacteria，NTM)，NTM在自然界中廣泛存在，屬于條件致病菌，目前已發(fā)現(xiàn)約160多種。NTM病具有與結(jié)核病臨床表現(xiàn)相似的全身中毒癥狀和局部組織損害，與結(jié)核病難以區(qū)分，但其治療卻與結(jié)核病有不同之處。2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)制定出《非結(jié)核分枝桿菌病診斷與處理指南》，2007年美國(guó)胸科協(xié)會(huì)(AmericanThoracicSociety,ATS)和美國(guó)傳染病學(xué)會(huì)(InfectiousDiseasesSocietyofAmerica,IDSA)也提出了NTM肺病的臨床和微生物學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，2種診斷標(biāo)準(zhǔn)大致相同，均提出NTM肺病的診斷主要依靠病原微生物學(xué)[1-2]。NTM菌種篩查和藥敏結(jié)果在流行病學(xué)上和臨床診斷、治療上都有重要意義[3]。本實(shí)驗(yàn)采用BACTECMGIT960液體培養(yǎng)法聯(lián)合CLSIM24-A微量肉湯稀釋法的快速藥敏試驗(yàn)與經(jīng)典的L-J固體培養(yǎng)法和絕對(duì)濃度藥敏法作比較，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2012年1—12月在河北省胸科醫(yī)院就診的患者，采集痰、支氣管鏡灌洗液、膿標(biāo)本進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)，剔除重復(fù)送檢患者，共分離出48株NTM。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株：結(jié)核分枝桿菌H37Rv、牛分枝桿菌購(gòu)自生物制品研究所。

1.3 儀器、試劑：BACTECMGIT960培養(yǎng)儀，BBLpreparedculturemedia培養(yǎng)管均購(gòu)自美國(guó)BD公司；快速藥敏試驗(yàn)用肉湯購(gòu)于上海積彩醫(yī)療器械有限公司公司;改良L-J培養(yǎng)基及藥敏培養(yǎng)基按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[4]自制。

1.4 方法：快速藥敏試驗(yàn)根據(jù)CLSIM24-A微量肉湯稀釋法，每種藥物選擇高低2個(gè)濃度，將藥物包被在96孔U型微量反應(yīng)板上。濃度分別為鏈霉素(streptomyci，SM)2、8mg/L,異煙肼(isoniazid，INH)0.4、1.6mg/L，利福平(rifampicin，RFP)2、8mg/L，乙胺丁醇(ethambutol，EMB)4、16mg/L，氧氟沙星(ofloxacinforinjection，OFX)2、8mg/L，左氧氟沙星(levofloxacin，LVFX)2、8mg/L，阿米卡星(amikacin，AK)1、4mg/L，卷曲霉素(capreomycin,CM)2.5、10μg/mL，丙硫異煙胺(protionamide，1314Th)10、40mg/L，力克肺疾(isoniazidaminosalicylate，Dpc)0.5、2mg/L，莫西沙星(moxifloxacin，Mfx)0.5、2mg/L，環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CPI)1、4mg/L，克拉霉素(clarithromycin，Clr)4、16mg/L，利福布丁(rifabutin,RFB)0.75、3mg/L，利奈唑胺(linezolid，Lz)2、8mg/L，加替沙星(gatifloxacin，Gfx)2、8mg/L。

L-J藥敏培養(yǎng)基按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[4]每種藥物高低2個(gè)濃度。分別為SM10、100mg/L，INH1、10mg/L，RFP50、250mg/L，EMB5、50mg/L，Dpc1、10mg/L，LVFX2、20mg/L

1.5 菌型判定：用于菌型鑒定的C2-羧酸肼噻吩(TCH)100mg/L，對(duì)硝基苯甲酸(PNB)500mg/L。PNB-、TCH+為人型結(jié)核菌；PNB-、TCH-為牛型結(jié)核菌；PNB+、TCH+為NTM。

2 結(jié) 果

2.1 2種方法NTM陽(yáng)性報(bào)告時(shí)間：48株NTM在BACTECMGIT960培養(yǎng)儀的陽(yáng)性報(bào)告時(shí)間2～20d，平均(7.0±5.3)d；L-J培養(yǎng)基陽(yáng)性報(bào)告時(shí)間7～52d，平均(17.5±10.2)d。2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.329，P<0.01)。

2.2NTM藥敏結(jié)果分析:在報(bào)告陽(yáng)性后涂片抗酸染色確定為抗酸菌陽(yáng)性，將培養(yǎng)物分別接種微量反應(yīng)板和L-J藥敏培養(yǎng)基，7～14d后觀察微量反應(yīng)板各孔的生長(zhǎng)情況，進(jìn)行菌型分型和獲得藥物MIC值。L-J常規(guī)藥敏試驗(yàn)28d后根據(jù)生長(zhǎng)狀況得到藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果。SM、INH、RFP、EMB、LVFX、Dpc這6種常用的抗結(jié)核藥物耐藥率均在90%以上，與L-J法檢出的耐藥率相差無(wú)幾，見表1。

微量肉湯稀釋法的快速藥敏試驗(yàn)還可以對(duì)OFLX、AK、CM、1314Th、Mfx、CPI、Clr、RFB、Lz、Gfx10種藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn) ，比L-J常規(guī)藥敏試驗(yàn)所做的藥物種類多，藥物選擇的范圍大，臨床用藥指導(dǎo)意義更大。

表1 NTM 2種藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Two kinds of susceptibility testing for nontuberculous mycobacteria (n=48，n，%)

Sm:streptomyci； Inh：sonicotinic acid hydrazide；Rfp：rifampicin;Emb:ethambutol; Lfx :levofloxacin;Dpc:isoniazid aminosalicylate

3 討 論

NTM廣泛存在于自然界,大部分是腐物寄生菌，主要見于水、土壤和氣溶膠。NTM的疏水特性形成的生物膜使其可持續(xù)生存于供水系統(tǒng)中。人可從環(huán)境中感染NTM而患病，水和土壤是重要的傳播途徑。與結(jié)核分枝桿菌比較，NTM毒力和致病性均較低，通常屬于機(jī)會(huì)性致病菌。NTM的易感者主要是慢性呼吸道疾病(慢性阻塞性肺疾病、肺結(jié)核殘余空洞、矽肺、支氣管擴(kuò)張癥、肺囊性纖維化等)和免疫抑制者特別是獲得性免疫缺陷病患者，在獲得性免疫缺陷病和免疫受損宿主中，NTM通常表現(xiàn)為播散性。NTM病肺病的臨床特點(diǎn)因?yàn)榕c結(jié)核極其相似而極易發(fā)生誤診或漏診，因而對(duì)于反復(fù)慢性咳嗽咳痰，尤其是有支氣管擴(kuò)張等慢性呼吸道疾病的患者，肺部出現(xiàn)上述病灶特點(diǎn)，應(yīng)警惕NTM病感染的可能[2]。

近年來(lái)NTM所致疾病報(bào)道的增多，越來(lái)越引起臨床對(duì)分枝桿菌培養(yǎng)和NTM分離鑒定的重視。由于NTM對(duì)常用抗結(jié)核藥物普遍耐藥，傳統(tǒng)菌種鑒定方法根據(jù)菌株生長(zhǎng)速度、色素產(chǎn)生、光反應(yīng)、生化反應(yīng)等進(jìn)行分群，繁瑣費(fèi)時(shí)，不利于指導(dǎo)臨床診斷[5]。因此，快速的菌型分型和藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)NTM病的確診和治療方案的調(diào)整顯得尤為重要。

L-J培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)法，NTM培養(yǎng)平均陽(yáng)性報(bào)告時(shí)間為(17.5±10.2)d，最快陽(yáng)性報(bào)告時(shí)間7d，最慢為52d，抗酸染色確定陽(yáng)性后接種藥敏培養(yǎng)基大約需要4～8周才能得到藥敏結(jié)果。已經(jīng)不能滿足臨床需求。因此，迫切需要一種簡(jiǎn)單快速的培養(yǎng)、菌種初篩和藥敏試驗(yàn)的方法，以幫助臨床制定合理有效的用藥方案。

利用BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)基進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)，非結(jié)核分枝桿菌平均陽(yáng)性報(bào)告時(shí)間為(7.0±5.3)d，最快陽(yáng)性報(bào)告時(shí)間為2d，最慢為20d。NTM在960培養(yǎng)管中不形成典型的條索狀生長(zhǎng)，通過(guò)抗酸染色確定為抗酸菌陽(yáng)性后，根據(jù)CLSI M24-A微量肉湯稀釋法原理，接種包被好的96孔U型微量反應(yīng)板上，培養(yǎng)7～14d后即可得到菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

藥敏試驗(yàn)藥物組合包括了常用的一線和二線抗結(jié)核藥物。有研究[6]顯示藥敏試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)NTM對(duì)常用的藥物SM、INH、RFP 3種藥物100%耐藥。另有研究[7]顯示NTM對(duì)EMB耐藥率90%以上，對(duì)Dpc、Ofx、Lfx、Pto、RFP耐藥率也達(dá)到90%以上，對(duì)Cip、Gfx、Mfx耐藥率達(dá)到70%以上。本研究48株NTM耐藥率非常高，可能與就診的患者大都經(jīng)過(guò)其他醫(yī)院的治療或者有不規(guī)范的化療經(jīng)歷有關(guān)。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)NTM的分型的檢驗(yàn)技術(shù)尚未普及，核酸探針、PCR技術(shù)、基因芯片和細(xì)胞壁脂肪酸色譜分析等新技術(shù)尚未成熟用于臨床診斷，傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)藥敏方法需要時(shí)間長(zhǎng)，我們利用現(xiàn)有BACTEC MGIT 960液體快速培養(yǎng)法，結(jié)合CLSI M24-A微量肉湯稀釋法可以使NTM的菌型初篩和藥敏結(jié)果時(shí)間縮短到15～30d，有利于臨床根據(jù)菌種初篩及藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果，及時(shí)更改治療方案，減輕患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

由于本研究樣本資料均來(lái)源于同一醫(yī)院，且樣本量不夠大，只能菌種初篩而不能準(zhǔn)確分型，故研究結(jié)論尚需要大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)和完善。

[1] Chinese MedicaI Association of tuberculosis．Guidline on diagnosis and treatment of non tuberculous myeobacterial diseases[J].Chin J Tuberculosis Respir Dis，2000，23：650-653.

[2] GRIFFITH DE，AKSAMIT T，BROWN-ELLIOTT BA，et al.An official ATS/IDSA statement：diagnosis，teeatment，and prevention of nontuberculous mycobaeterial diseases[J].Am J Respir Crit Care Med，2007，175(4)：367-416.

[3] 吳龍章，李一耕，蔡杏珊，等.同時(shí)從痰液、胸腔積液分離出鳥分枝桿菌1例[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2000，23(10)：601.

[4] 中國(guó)防癆協(xié)會(huì).結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程[J].中國(guó)防癆雜志，1996，18(1)：28-31.

[5] 梁建琴，吳雪瓊，張俊仙，等.應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-膜芯片技術(shù)快速鑒定分枝桿菌菌種[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004,25(5)：289-291.

[6] FUJITA Y,LSHII S,HIRANO S,et al.A case of lung cancer complicatedwith active non-tuberculous mycobacterium(NTM) infection successfully treated with anti-cancer agents and anti-NTM agents[J].Nihon Kokyuki Gakkai Zasshi,2011,49(11)：855-860.

[7] 史祥，尹洪云.58例非結(jié)核分枝桿菌肺病住院患者的臨床分析[J].臨床肺科雜志，2013,18(2)：311-312.

(本文編輯：劉斯靜)

TWOSETSOFNON-TUBERCULOUSMYCOBACTERIUMCULTUREMETHODANDDRUGSENSITIVITYTESTSTUDY

WANGYanbin1，WUHaifeng2*
(1.ClinicalLaboratory，BloodCenterofHebeiProvince,Shijiazhuang050061,China2.ClinicalLaboratory，ChestHospitalofHebeiProvince,Shijiazhuang050041,China)

CT:ObjectiveTostudytheBACTECMGIT960liquidculturemethodandtheCLSIM24-Abrothmicrodilutionmethodforrapidsusceptibilitytestingthesignificanceofnon-tuberculousmycobacteria.MethodsTheBACTECMGIT960liquidculturebrothmicrodilutionmethodcombinedrapidsusceptibilitytesting,andL-Jsolidculturemethodcombinedtheabsoluteconcentrationsusceptibilitymethodwererespectivelyusedin48strainswithnontuberculousmycobacteri,theculturetimeandsensitivityreportingperiodoftwocombinationmethodswerecompared.ResultsTheaveragepositivereporttimein48strainsofnontuberculousmycobacteriaculturewithBACTECMGIT960instrumentwas(7.0±5.3)d,whilethatofL-Jmediawas(17.5±10.2)d,incomparisontheresultsoftwomethodsweresignificantlydifferent(P<0.05),thereportedtimeofbrothmicrodilutionFranceresultswas7-14d,thereporttimeofL-Jsolidsusceptibilitytestwas28d,thecomparisonshowedsignificantdifference,twokindsofsusceptibilitytestingmethodsforthesametypeofdrugresistancerateanalysisshowednosignificantdifference(P>0.05),brothmicrodilutionmethodcandetectmoretypesofdrugsthantheL-Jmethod.ConclusionBACTECMGIT960liquidculturebrothmicrodilutionmethodcombinedrapidsusceptibilitytestinghasobviousadvantagesoverL-Jsolidculturemethodandtheabsoluteconcentrationsusceptibilitymethodintheincubationtimeandsusceptibilityresultsreportingtimetypes.

nontuberculousmycobacteria；microbialsensitivitytests；bacteriologicaltechniques

2013-10-22；

2013-12-30

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(20100208)

王艷彬(1978-)，男，河北藁城人，河北省血液中心主管檢驗(yàn)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事病毒學(xué)檢驗(yàn)研究。

*通訊作者。E-mail：haifengwu77@163.com

R378.91

A

1007-3205(2014)07-0797-04