高品一，金 梅，楊 頔，蔣福宇，張文超，張振學(xué)，劉學(xué)貴，*

(1.沈陽化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽110142;2.沈陽化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，遼寧沈陽 110142)

金櫻子(Rose Laevigata Michx.)，又名油瓶果子、糖罐子、黃茶瓶、倒掛金鉤、蜂糖罐等，是薔薇科薔薇屬植物。其根、莖、葉、果、花均可入藥。廣泛分布在我國的東南、西南、華中及華南等地區(qū)，是一種開發(fā)前景非常好的野生經(jīng)濟(jì)植物。藥理研究顯示金櫻子果實(shí)具有抑菌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、促進(jìn)胃液分泌、降血脂等作用，主要用于治療尿頻遺尿、遺精滑精、久瀉久痢、白帶過多、婦女子宮脫垂等癥［1－5］，其藥理作用可能與黃酮類物質(zhì)有關(guān)系。黃酮類化合物是一類以2－苯基色原酮為基本母核的多酚類化合物，其結(jié)構(gòu)常連接甲基、酚羥基、異戊烯基、甲氧基等官能團(tuán)。另外它還可以與糖結(jié)合形成苷［6］。黃酮類物質(zhì)廣泛存在于各類植物中，且廣泛應(yīng)用于化工、食品和醫(yī)藥工業(yè)中［7］。此外，研究證實(shí)從金櫻子中提取出來的黃酮有多種藥理作用，包括抗氧化作用、降血脂的功效，以及保護(hù)肝臟的作用等［8－9］。目前，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)黃酮類物質(zhì)提取的研究已經(jīng)成為一個(gè)熱點(diǎn)，并且對(duì)金櫻子黃酮類化合物提取方法及含量測(cè)定的報(bào)道較多，如盧俊［10］等利用超聲波輔助法提取金櫻子中黃酮類化合物，黃酮類化合物的提取率為15.28%;薛梅［11］等運(yùn)用微波提取技術(shù)提取金櫻子中黃酮類化合物，測(cè)得中藥金櫻子中總黃酮的含量為6.49%。本實(shí)驗(yàn)以金櫻子果實(shí)為原料，探討傳統(tǒng)加熱提法及微波助提法提取金櫻子果實(shí)中黃酮的工藝，旨在為金櫻子綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金櫻子 江西中藥廠;蘆丁對(duì)照品 陜西森弗高科實(shí)業(yè)有限公司，純度95%;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等 均為分析純。

HH系列恒溫水浴鍋 江蘇金壇中大儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士步琪有限公司;UV－4100系列紫外可見分光光度計(jì) 日本日立;電子天平TD5102 余姚市金諾天平儀器有限公司;SHZ－D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器責(zé)任公司;WP800TL23－K3型微波爐 佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的處理 稱取100g中藥金櫻子果實(shí)并將其去籽，再粉碎置于培養(yǎng)皿內(nèi)，然后在105℃烘箱中烘干再研磨成粉末，過40目篩置于干燥的廣口瓶?jī)?nèi)密封保存。

1.2.2 提取工藝最佳參數(shù)的確定 單因素實(shí)驗(yàn)中，在傳統(tǒng)加熱提法和微波助提法的條件下，依次改變提取金櫻子果實(shí)中黃酮含量的四個(gè)影響因素，即:乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)、溶媒量(D)。以黃酮得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行研究和分析，并確定四因素三水平的最佳參數(shù)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)分析。實(shí)驗(yàn)中的水平及編碼表見表1，表2。

表1 傳統(tǒng)加熱提法正交實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Traditional extraction of facters and levels of orthogonal test

表2 微波助提法正交實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 2 Microwave－assisted extraction process of facters and levels of orthogonal test

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 根據(jù)藥典［12］，精密稱取120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品200mg放置100mL的容量瓶中，加入無水甲醇70mL置于水浴上微熱使其全部溶解。放冷至室溫，加無水甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取10mL置于100mL容量瓶?jī)?nèi)，加水稀釋至刻度，搖勻。即獲得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2mg/mL)。精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL。分別置于 25mL 容量瓶中，各加水至6mL，再加入5%的亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min。再各加入10%的硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min。各加入5%氫氧化鈉溶液1mL，加水至刻度，搖勻放置15min。以第一瓶不加蘆丁對(duì)照品的管作為空白對(duì)照，在500nm處測(cè)其吸光度A。以吸光度A作為縱坐標(biāo)，濃度 C作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 樣品液中黃酮含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取105℃常壓下干燥至恒重的金櫻子果實(shí)的浸膏1g研細(xì)，加50mL無水甲醇，水浴浸泡24h，超聲20min，重復(fù)操作一次，合并濾液，置于100mL容量瓶?jī)?nèi)，用少量無水甲醇洗滌容器，溶液一起并入容量瓶?jī)?nèi)，加無水甲醇稀釋至刻度，搖勻，即獲得供試品溶液。量取供試品溶液10mL，置100mL容量瓶?jī)?nèi)，加水稀釋至刻度，搖勻。再量取4mL，置于25mL容量瓶中。加水至6mL后按1.2.3項(xiàng)操作。在500nm處測(cè)其吸光度A，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品液中黃酮的含量，再由下式計(jì)算黃酮得率(%，為提取獲得的黃酮占金櫻子果實(shí)重量的比率)。

式中:C為測(cè)量液黃酮濃度(mg/mL);25為稀釋液體積(mL);W為原料重量(g)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行做三次，計(jì)算平均值。

1.2.5 乙醇濃度影響實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取5份10g金櫻子果實(shí)粉末分別置于圓底燒瓶中，各加入45%、55%、65%、75%、85%乙醇溶液 100mL，85℃水浴回流提取2次，各回流1h，離心后取上清液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定其吸光值并計(jì)算黃酮得率。以乙醇濃度作為橫坐標(biāo)，黃酮得率作為縱坐標(biāo)，繪制黃酮得率隨乙醇濃度變化曲線。

準(zhǔn)確稱取5份10g金櫻子果實(shí)粉末分別置于圓底燒瓶中，各加入45%、55%、65%、75%、85%乙醇溶液100mL，置于已設(shè)定為400W的微波爐中進(jìn)行微波提取2次，每次8min，離心后取上清液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定其吸光值并計(jì)算黃酮得率。以乙醇濃度作為橫坐標(biāo)，黃酮得率作為縱坐標(biāo)，繪制黃酮得率隨乙醇濃度變化曲線。

1.2.6 提取時(shí)間影響實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取5份10g金櫻子粉末分別置于圓底燒瓶中，各加入75%乙醇溶液100mL，85℃水浴回流提取 2 次，分別回流30、60、90、120、150min，離心后取上清液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定其吸光值并計(jì)算其黃酮得率。

準(zhǔn)確稱取5份10g金櫻子粉末分別置于圓底燒瓶中，各加入75%乙醇溶液100mL，置于已設(shè)定為400W的微波爐中進(jìn)行微波提取2次，每次回流4、6、8、10、12min，離心后取上清液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定其吸光值并計(jì)算其黃酮得率。

1.2.7 提取次數(shù)影響實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取5份10g金櫻子粉末分別置于圓底燒瓶中，各加入75%乙醇溶液100mL，分別在 85℃ 水浴下各回流提取 1、2、3、4、5次，回流1h，離心后取上清液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定其吸光值并計(jì)算其黃酮得率。

準(zhǔn)確稱取5份10g金櫻子粉末分別置于圓底燒瓶中，各加入75%乙醇溶液100mL，并置于已設(shè)定為400W的微波爐中各回流提取 1、2、3、4、5 次，回流1h，離心后取上清液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定其吸光值并計(jì)算其黃酮得率。

1.2.8 溶媒量影響實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取5份10g金櫻子粉末分別置于圓底燒瓶中，各加入75%乙醇溶液80、90、100、110、120mL，85℃水浴回流提取 2 次，每次回流1h，離心后取上清液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定其吸光值并計(jì)算其黃酮得率。

準(zhǔn)確稱取5份10g金櫻子粉末分別置于圓底燒瓶中，各加入 75% 乙醇溶液 80、90、100、110、120mL，并置于已設(shè)定為400W的微波爐中回流提取2次，每次回流1h，離心后取上清液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定其吸光值并計(jì)算其黃酮得率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照1.2.3方法，得到回歸方程為:y=9.9571x－0.0188，R2=0.9997，說明對(duì)照品在 0.008～0.048mg/mL成良好線性。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響見圖1和圖2。由圖1可知，黃酮得率隨著乙醇濃度的增大而增加，當(dāng)乙醇濃度超過65%時(shí)，黃酮得率逐漸減小。即，當(dāng)乙醇濃度為65%時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大(約為6.8%)。由圖2可知:黃酮得率隨著乙醇濃度的增大而增加，當(dāng)乙醇濃度超過65%時(shí)，黃酮得率逐漸減小。即，當(dāng)乙醇濃度為65%時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大(約為7.8%)。

比較:傳統(tǒng)加熱提法和微波助提法提取金櫻子果實(shí)中黃酮含量的最佳乙醇濃度為65%。當(dāng)乙醇濃度偏低或偏高時(shí)，黃酮得率均有所降低。這可能是因?yàn)橹械葷舛鹊囊掖妓芤浩錁O性與金櫻子果實(shí)黃酮的極性相近，易于黃酮的溶出;而低濃度的乙醇水溶液其極性比較大，雜質(zhì)的溶出量大大增加，所得的黃酮含量較低［13］;高濃度的乙醇水溶液具有強(qiáng)烈的吸水作用并且極性較小，影響細(xì)胞的溶脹，導(dǎo)致黃酮得率的降低，其主要用于中草藥中的揮發(fā)油、樹脂等的溶出［14］。

圖1 傳統(tǒng)加熱提法乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響Fig.1 Ethanol concentration on thefalconoid extraction yield by traditional extraction

圖2 微波助提法乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響Fig.2 Ethanol concentration on the falconoid extraction yield by microwave－assisted extraction

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 由圖3可知:隨著提取時(shí)間的增加，黃酮得率也隨之先增加后減少。當(dāng)提取時(shí)間為30～60min時(shí)，黃酮得率增加得比較快，且在90min處達(dá)到最大值(約為7.9%);當(dāng)提取時(shí)間為90～150min時(shí)，黃酮得率略有所下降，這可能是由于提取時(shí)間過長(zhǎng)，乙醇大量揮發(fā)，而且長(zhǎng)時(shí)間水浴加熱很可能促使金櫻子果實(shí)中黃酮類物質(zhì)的活性成分遭損壞，穩(wěn)定性變差［15］，直接影響其提取效率。由圖顯示，90min處的黃酮得率較60min處的黃酮得率略高，但兩者相差不大，因而從節(jié)能的角度考慮，選擇提取時(shí)間為60min更合理。

圖3 傳統(tǒng)加熱提法提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.3 Extraction time on the falconoid extraction yield by traditional extraction

由圖4可知:隨著提取時(shí)間的增加，黃酮得率也不斷增加。當(dāng)提取時(shí)間為4～6min時(shí)，黃酮得率增加得比較迅速;當(dāng)6～12min時(shí)，黃酮得率增加得比較緩慢。運(yùn)用微波助提法，在4～12min提取時(shí)間范圍內(nèi)，延長(zhǎng)提取時(shí)間有利于金櫻子果實(shí)中黃酮的提取。但提取時(shí)間過長(zhǎng)，不但影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度且浪費(fèi)資源，所以選6min為最佳提取時(shí)間。

圖4 微波助提法提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.4 Extraction time on the falconoid extraction yield by microwave－assisted extraction

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)總黃酮得率的影響 由圖5、圖6可知:回流提取3次，黃酮得率達(dá)到最大值。表明回流提取次數(shù)越多，得到的黃酮越多。增加回流提取次數(shù)對(duì)提高黃酮得率有利。但是提取次數(shù)過多，不但會(huì)影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)展速度，而且也浪費(fèi)資源。則確定提取次數(shù)1、2、3次為正交實(shí)驗(yàn)的三個(gè)水平。

圖5 傳統(tǒng)加熱提法提取次數(shù)對(duì)黃酮得率的影響Fig.5 Extraction times on the falconoid extraction yield by traditional extraction

圖6 微波助提法提取次數(shù)對(duì)黃酮得率的影響Fig.6 Extraction times on the falconoid extraction yield by microwave－assisted extraction

2.1.5 溶媒量對(duì)總黃酮得率的影響 由圖7、圖8可知:隨著乙醇體積的不斷增加，黃酮得率也不斷加大。當(dāng)溶媒量在8～10倍的范圍內(nèi)，黃酮得率顯著增加;當(dāng)溶媒量在10～12倍的范圍內(nèi)，黃酮得率緩慢增加或基本穩(wěn)定。這可能是由于溶劑量的不斷增加可以提高金櫻子果實(shí)與溶劑之間黃酮類化合物的濃度差，有利于黃酮類化合物向溶劑中擴(kuò)散［16］，從而增強(qiáng)了黃酮的溶解率，提高了黃酮得率。當(dāng)溶劑用量達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，原料表面與溶劑之間的濃度差對(duì)黃酮溶解度的影響減小，則黃酮的得率緩慢增加或基本穩(wěn)定［17］。考慮到溶劑量過大不僅浪費(fèi)溶劑，而且還給濃縮帶來一定的困難，所以傳統(tǒng)加熱提法和微波助提法提取金櫻子果實(shí)中黃酮含量的最佳溶媒量為10倍。

圖7 傳統(tǒng)加熱提法溶媒量對(duì)黃酮得率的影響Fig.7 The amount of solvent on the falconoid extraction yield by traditional extraction

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)可知，乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)和溶媒量等因素影響金櫻子果實(shí)的黃酮得率。以黃酮的得率為衡量指標(biāo)，按L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)確定最佳提取工藝條件。

圖8 微波助提法溶媒量對(duì)黃酮得率的影響Fig.8 The amount of solvent on the falconoid extraction yield by and microwave－assisted extraction

2.2.1 傳統(tǒng)加熱提法 正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理是采用正交實(shí)驗(yàn)直觀分析的方法，統(tǒng)計(jì)不同水平條件下提取出金櫻果實(shí)黃酮的平均含量，以極差R(R為極大值與極小值之差)進(jìn)行分析(見表3)。極差R的結(jié)果表明，乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、溶媒量4個(gè)因素對(duì)金櫻果實(shí)總黃酮提取含量的影響的顯著性為:乙醇濃度(A)＞溶媒量(D)＞提取次數(shù)(C)＞提取時(shí)間(B)。乙醇濃度(A)對(duì)黃酮得率有顯著影響，提取次數(shù)(C)和溶媒量(D)對(duì)結(jié)果影響次之，而提取時(shí)間(B)對(duì)黃酮得率影響不大。表3中k值顯示，最優(yōu)水平搭配為A3B3C2D2，即10倍溶媒量，用75%乙醇溶解，提取2次，每次70min。

表3 傳統(tǒng)加熱提法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Traditional extraction process of orthogonal experimental results in Table

2.2.2 微波助提法 由直觀分析(表4)可見，表中極差結(jié)果表明，乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、溶媒量4個(gè)因素對(duì)金櫻果實(shí)總黃酮提取含量的影響的顯著性為:溶媒量(D)＞乙醇濃度(A)＞提取時(shí)間(B)＞提取次數(shù)(C)。乙醇濃度(A)和溶媒量(D)對(duì)黃酮得率有顯著影響，提取時(shí)間(B)和提取次數(shù)(C)對(duì)結(jié)果影響不大。表4中k值顯示，最優(yōu)水平搭配為A2B2C3D2，即10倍溶媒量，用65%乙醇溶解，提取3次，每次6min。

表4 微波助提法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 microwave－assisted extraction process of orthogonal experimental results in Table

2.3 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證

取6份金櫻子果實(shí)粉末，每份10g。其中3份按照上述傳統(tǒng)加熱提法提取金櫻子果實(shí)中黃酮的最佳工藝條件進(jìn)行提取，即按10倍溶媒量，用75%乙醇溶解，提取2次，每次70min。而另外3份按照微波助提法的最佳工藝條件進(jìn)行提取，即按10倍溶媒量，用65%乙醇溶解，提取3次，每次6min。將其離心后取上清液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定其吸光值并計(jì)算其黃酮得率，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，兩種提取方法之間存在較大的差異，微波輔助提取18min的黃酮含量(9.06%)就超過了傳統(tǒng)加熱提取140min的效果(7.84%)，大大縮短了黃酮提取所用的提取時(shí)間，且微波助提法的黃酮得率平均值為9.06%(RSD=1.01%)，這表明該實(shí)驗(yàn)方案穩(wěn)定，得率較高，具有實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值。

表5 優(yōu)化工藝條件的驗(yàn)證結(jié)果Table 5 Results of the text of optimum process

3 結(jié)論

本文通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了金櫻子果實(shí)中黃酮的提取工藝條件，獲得了穩(wěn)定性較高且可行的工藝條件，即傳統(tǒng)加熱提法的最佳工藝條件為10倍溶媒量，用75%乙醇溶解，提取2次，每次70min，微波助提法的最佳工藝條件為10倍溶媒量，用65%乙醇溶解，提取3次，每次6min。通過對(duì)比，微波助提法不僅大大縮短了提取時(shí)間而且所得黃酮含量也比較高。

這兩個(gè)最佳工藝條件的獲得，為金櫻子黃酮提取工藝的研究提供了一定的理論依據(jù)，具有實(shí)際的指導(dǎo)意義和良好的應(yīng)用前景。

［1］姚晏群.海晏縣農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展現(xiàn)狀調(diào)查分析［J］.青海農(nóng)牧業(yè)，2008(2):24.

［2］Pin－Yi Gao，Ling－Zhi Li，Ying Peng，et al.Triterpenes from fruits of Rosa laevigata［J］.Biochemical Systematics and Ecology，2010，38:457－459.

［3］Na Zeng，Yang Shen，Ling－Zhi Li，et al.Anti－ inflammatory Triterpenes from the Leaves of Rosa Laevigata［J］.Journal of Natural Products，2011，74(4):732－738.

［4］周志軍.地市級(jí)農(nóng)科院種子產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新思路探討［J］.吉林蔬菜，2008(5):17－18.

［5］禹桂芳，丁建江，何寧，等.寧夏涇源縣特色林木種苗產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及對(duì)策［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008(8):48.

［6］Aoki T，Akashi T，Ayabe S.Flavonoids of Leguminous Plants:Structure，Biological Activity，and Biosynthesis［J］.Journal of Plant Research，2000，113:475－488.

［7］程秋月，郭菁，張成義.黃酮類化合物藥理作用的研究［J］.北華大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，12(2):180－183.

［8］Liu Yuetao，Lu Binan，Xu Lina，et al.The antioxidant activity and hypolipidemic activity of the total flavonoids from the fruit of Rose leavigata Michx［J］.Natural science，2010，2(3):175－183.

［9］Liu Yuetao，Lu Binan，Peng Jinyong.Hepatoprotective activity of the total flavonoids from Rosa laevigata Michx fruit in mice treated by paracetamol［J］.Food Chemistry，2011，125(2):719－725.

［10］盧俊，陳福北，溫彩蓮.超聲波輔助提取金櫻子中黃酮類化合物工藝研究［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械，2011:145－148.

［11］薛梅，王自軍，閆豫君，等.金櫻子中總黃酮和多糖的微波提取與含量測(cè)定［J］.食品工業(yè)科技，2005，26(10):134－135，137.

［12］中國藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:218.

［13］Yan－Ling Wang，Guang－Sheng Xi，Yong－Chun Zheng，et al.Microwave－assisted extraction of flavonoids from Chinese herb Radix puerariae(Ge Gen)［J］.Journal of Medicinal Plants Research，2010，4(4):304－308.

［14］彭程程，王青山，趙國祥，等.黃酮類化合物的研究進(jìn)展［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工:學(xué)刊，2010，208(5):39－43.

［15］張春紅，許寧，劉長(zhǎng)江，等.微波輔助法提取野生軟棗獼猴桃莖黃酮的工藝優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(12):335－337.

［16］王青豪，方芳，張熊祿.微波輔助提取絞股藍(lán)黃酮工藝研究［J］.食品科學(xué)，2010，31(22):150－151.

［17］蔣雪蕾，劉軍海，李安源.超聲輔助正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取桔皮總黃酮的工藝研究［J］.廣東化學(xué)，2013，40(5):53－54.