陳仁輝，范兆慧，高 輝

(1.福建警察學院刑事科學技術(shù)系，福建 福州 350007；2.福州市公安局倉山分局刑偵大隊，福建 福州 350007；3.吉首大學醫(yī)學院藥理學教研室，湖南 吉首 416000)

大鼠DAI特殊染色觀察及NF-κB的表達*

陳仁輝1，范兆慧2，高 輝3

(1.福建警察學院刑事科學技術(shù)系，福建 福州 350007；2.福州市公安局倉山分局刑偵大隊，福建 福州 350007；3.吉首大學醫(yī)學院藥理學教研室，湖南 吉首 416000)

為了分析大鼠彌漫性軸索損傷(DAI)后病理學變化及核因子-κB(NF-κB)的表達，探討了NF-κB在彌漫性軸索損傷中的作用，構(gòu)建了大鼠DAI動物模型.運用Glees-Marsland染色法和Weil氏染色法觀察傷后不同時間段的病理學改變，并運用免疫組化SABC法觀察NF-κB的表達.實驗結(jié)果表明，大鼠彌漫性軸索損傷后1 h即可觀察到部分軸索腫脹、斷裂，髓鞘水腫、分層等現(xiàn)象，24 h可見典型軸索收縮球形成，髓鞘崩解呈篩網(wǎng)狀改變，72 h軸索斷裂數(shù)量、范圍及髓鞘篩網(wǎng)狀改變達到高峰；傷后1 h，腦組織內(nèi)可見NF-κB陽性細胞，傷后3 h陽性細胞數(shù)增多，傷后24 h達到高峰，持續(xù)到72 h，傷后7 d，仍可見陽性細胞表達，但數(shù)量減少.對照組細胞核未見陽性表達.大鼠彌漫性軸索損傷后NF-κB表達增加，可能與軸索繼發(fā)性損傷有關(guān).

彌漫性軸索損傷；特殊染色法；NF-κB;免疫組織化學

彌漫性軸索損傷(Diffuse Axonal Injury，DAI)是顱腦損傷的一種重要形式.其最突出的臨床表現(xiàn)是在沒有明確局灶損傷的情況下出現(xiàn)快速的進行性加重意識障礙.DAI由于缺乏特異性的神經(jīng)定位體征以及影象學改變，其最終診斷需要通過組織病理學.大量的研究表明，DAI的發(fā)生是由機械性的原發(fā)損傷引起并與繼發(fā)性的蛋白水解通路激活共同參與所致，但是最近的研究認為炎癥反應(yīng)可能也參與了DAI的發(fā)生發(fā)展[1].

NF-κB是一種具有多向性轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)節(jié)因子，其主要作用是參與多種與免疫、炎癥、細胞凋亡等生理和病理過程相關(guān)基因的表達調(diào)控，通路是炎癥反應(yīng)通路中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2].筆者構(gòu)建了大鼠DAI動物模型，運用Glees-Marsland染色法、Weil氏染色法觀察傷后不同時間段軸索的病理學改變，并對相應(yīng)時間段NF-κB的表達變化進行觀察，探討NF-κB與DAI經(jīng)過時間及損傷程度的關(guān)系.

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1 動物分組 健康成年雄性SD大鼠45只(福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供)，其質(zhì)量為280～300 g，隨機分為8個實驗組(分別在打擊后30 min，1 h，3 h，6 h，12 h，24 h，72 h，7 d處死)及1個對照組，共9組.每組5只大鼠.

1.1.2 主要試劑 Weil蘇木精、4%鐵明釩、硝酸銀、氯化金(上?；瘜W試劑總廠)、硫代硫酸鈉、飽和氨水，兔抗大鼠NF-κB p65多克隆抗體、DAB顯色試劑盒及SABC試劑盒(武漢博士德公司).

1.2實驗方法

1.2.1 DAI動物模型制作 實驗組參照文獻[3]中報道的方法建立DAI動物模型，用1%戊巴比妥鈉作腹腔注射(每千克大鼠注射35 mg)，麻醉成功后，大鼠頭部中線切開暴露顱骨，將直徑10 mm、厚3 mm的打擊墊片用高分子聚脂固定于顱頂?shù)墓跔羁p與人字縫之間的中央部，然后將大鼠俯臥固定已知厚度及彈性系數(shù)的海綿床上，待大鼠恢復(fù)意識，有肢體活動時，移至有機玻璃管下端，墊片正對管中央.質(zhì)量為450 g的鐵棒從2 m高度自管內(nèi)自由墜落至打擊墊片上，立即移開海綿床以免二次損傷.在設(shè)定的時間點處死大鼠.1.2.2 組織及切片處理 打開顱骨后迅速用4%多聚甲醛液預(yù)固定，取出大鼠全腦于多聚甲醛液后固定12 h，沿大腦正中裂矢狀切開大腦、小腦、腦干，于正中切面左右外側(cè)3 mm處切取左右大腦皮質(zhì)、胼胝體、丘腦以及腦干組織各一塊，分別做常規(guī)石蠟包埋.切片厚度為5 μm，分別作HE染色、Glees-Marsland染色、Weil氏染色[4]及NF-κB免疫組織化學染色.

2 實驗結(jié)果

2.1Glees-Marsland染色

打擊后1 h即可觀察到部分神經(jīng)纖維不規(guī)則增粗、腫脹、呈波浪樣改變，6 h神經(jīng)纖維明顯增粗、腫脹并呈串珠狀、螺旋狀改變，斷端收縮球形成，12 h收縮球較為明顯，24 h可見典型軸索收縮球，72 h軸索斷裂數(shù)量及范圍達到高峰(圖1).對照組神經(jīng)纖維排列整齊有序.

2.2Weil氏染色

圖1 腦損傷后腦干軸索腫脹、斷裂改變(G-M×400)

圖2 腦損傷后腦干神經(jīng)纖維脫髓鞘改變(Weil×400)

打擊后1 h神經(jīng)髓鞘水腫、分層，6 h可見髓鞘崩解，聚集成團，12～24 h髓鞘病變范圍擴大，組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，部分呈空泡狀、篩網(wǎng)狀改變，72 h髓鞘篩網(wǎng)狀改變達高峰(圖2).對照組髓鞘無水腫、分層改變.

2.3NF-κB免疫組織化學染色

圖3 腦損傷后1 h陽性表達(SABC×400)

DAI后1 h，在腦組織內(nèi)可見NF-κB少量細胞核表達(圖3)，呈棕黃色顆粒，著色較淺；傷后3 h染色細胞核增多，著色加深(圖4)，呈散分布，與對照組比較有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，隨著損傷時間的延長，陽性細胞數(shù)增加，染色加深；傷后24 h，表達達到高峰(圖5)，持續(xù)到72 h，傷后7 d，仍可見陽性細胞表達，但數(shù)量減少，與對照組比較有統(tǒng)計學意義(p<0.05).最顯著的表達區(qū)域在大腦皮層、腦干，其他部位的表達略有差異，但表達趨勢一致.對照組細胞核未見陽性表達.NF-κB表達情況見表1(例數(shù)n=5).

圖4 腦損傷后3 h陽性表達(SABC×400)

圖5 腦損傷后24 h陽性表達(SABC×400)

表1 對照組及DAI組腦組織中NF-κB陽性單位值

注 肩標a表示P<0.05,肩標b表示P<0.01.

3 討論

彌漫性軸索損傷一般發(fā)生在頭部遭受剪切力或加速性外力作用后，腦內(nèi)不同密度的組織產(chǎn)生不同的位移，造成這些界面處軸索的腫脹斷裂，其主要病理改變集中于神經(jīng)軸索聚集區(qū)，如灰白質(zhì)交界處、胼胝體、腦干、小腦及內(nèi)囊基底節(jié)區(qū)，軸縮球的形成是確認彌漫性軸索損傷的主要依據(jù).軸索的膨脹和斷裂可由外力直接作用引起，但絕大多數(shù)情況下則是傷后病理生理變化的結(jié)果，軸縮球的形成是一個繼發(fā)的病生過程，病理學稱之為非中斷性軸索損傷[6].非中斷性軸索損傷后至延遲性軸索斷裂及軸縮球的形成，這期間是一個復(fù)雜的病理生理學過程.Glees-Marsland染色、Weil氏染色作為神經(jīng)組織特殊染色方法，可以很好地顯示神經(jīng)纖維軸索、髓鞘的病理學改變.筆者研究發(fā)現(xiàn)DAI后早期僅可見部分神經(jīng)纖維不規(guī)則增粗、腫脹,呈波浪樣改變，隨著損傷時間的延長，軸索腫脹程度加重，出現(xiàn)了斷裂、軸索球的形成，并于傷后72 h軸索斷裂數(shù)量及范圍達到高峰.在損傷早期僅見少量髓鞘水腫、分層改變，隨著損傷時間的延長，髓鞘出現(xiàn)崩解，髓鞘病變范圍擴大，呈空泡狀、篩網(wǎng)狀改變，于傷后72 h達高峰.上述病理學改變，主要位于腦干、胼胝體等腦中線部位，腦白質(zhì)部位多見，這與DAI損傷的生物力學機制有關(guān)，也與神經(jīng)纖維的分布有關(guān).特殊染色結(jié)果證實軸索斷裂不是單純外力即可作用所致，“繼發(fā)性腦損傷”因素在DAI的發(fā)展中起著重要的作用.

NF-κB在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，并且在腦組織內(nèi)的活性相對高于其他組織.在正常情況下，它以非活性形式存在胞漿中，當細胞受到外界刺激時，NF-κB被激活，并由胞質(zhì)移位至胞核[7].文中研究結(jié)果表明：DAI后1 h，在腦組織內(nèi)可見NF-κB在少量細胞核表達，隨著時間的延長，陽性細胞數(shù)增加，染色加深，傷后24 h，表達達到峰值，持續(xù)到72 h，傷后7 d，仍可見陽性細胞表達，但數(shù)量減少.NF-κB的表達規(guī)律和神經(jīng)纖維損傷程度變化規(guī)律具有某種程度的一致性.

最新的研究表明，炎癥反應(yīng)參與了DAI的發(fā)生發(fā)展，軸索損傷時髓鞘崩解產(chǎn)物激活炎性細胞，如小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞，上調(diào)炎癥因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α、(IL)-1等，參與DAI的發(fā)展[1].NF-κB作為真核細胞轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄功能，是許多生理活動的分子基礎(chǔ)，其中對編碼炎性分子基因的轉(zhuǎn)錄是NF-κB最主要的功能.錢偉等[8]研究發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷后NF-κB存在高度活化，并長時間維持，通過上調(diào)炎癥因子TNF-α的表達直接或間接導(dǎo)致顱腦的損傷.文中研究結(jié)果表明，DAI后隨著損傷時間的延長，神經(jīng)纖維損傷程度逐漸加重，軸索髓鞘崩解產(chǎn)物增多，NF-κB表達也逐漸增強，提示NF-κB的激活程度和DAI損傷程度有關(guān)聯(lián)，可能通過啟動炎癥反應(yīng)通路參與DAI的繼發(fā)性損傷.

目前DAI尚無特異性的治療手段，這與其發(fā)病機制的復(fù)雜性有關(guān).炎癥反應(yīng)作為新的DAI發(fā)病機制，積極控制炎癥反應(yīng)也應(yīng)是治療DAI的策略之一.NF-κB在DAI中的表達激活提示，它可能通過啟動的炎癥反應(yīng)通路參與DAI的發(fā)生發(fā)展，阻斷NF-κB活化途徑，抑制NF-κB活性，減少NF-κB的活化因素，是可能會成為減輕DAI的有效途徑之一.

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(責任編輯 陳炳權(quán))

SpecialStainingPathologicChangesandtheExpressionofNF-κBAfterDiffuseAxonalInjuryinRats

CHEN Renhui1,FAN Zhaohui2,GAO Hui3

(1.Department of Criminal Sciences and Technology,Fujian Police Institute,Fuzhou 350007,China;2.Criminal Investigation Detachment of Public Security Bureau Cangshan Branch,Fuzhou 350007,China;3.Department of Pharmacology,Medical College of Jishou University,Jishou 416000,Hunan China)

To observe the pathologic changes and the expression of nuclear factor-kappa B(NF-κB)after diffuse axonal injury(DAI) in rats,its mechanism is firstly explored.The rat DAI model was established.Immunohistochemical SABC method was used to observe the expression of NF-κB,combining Glees-Marsland and Weil staining to observe the pathologic changes in different stage of DAI.Swollen and ruptured axon were found in brain tissue 1 h after DAI,and myelin sheath showed edema,delamination,marked axonal retraction ball and screen shape changes were detected after 24 h,and those morphological changes reached the peak after 72 h.The expression of NF-κB could be detected 1h after injury,the positive cells increased after 3 h,peaked after 24 h,and kept this tendency for 72 h.The positive cells decreased after 7 d.The control group showed negative staining.The findings showed that the expression of NF-κB increased in rat DAI model.The NF-κB may play an important role in secondary axonal injury.

diffuse axonal injury;special staining;nuclear factor-kappa B(NF-κB);immunohistochemistry

1007-2985(2014)05-0063-04

2014-03-20

福建省教育廳科技項目(JA13339)；湖南省科技廳科技計劃資助項目(2013SK3179)

陳仁輝(1979—)，男，安徽寧國人，福建警察學院刑事科學技術(shù)系講師，博士生，主要從事閉合性顱腦損傷的分子病理學研究.

R89

B

10.3969/j.issn.1007-2985.2014.05.015