賀樂(lè)奇 申春梅 王龍武

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200240；2.長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南長(zhǎng)沙 410129)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的三大惡性腫瘤之一，早期診斷較為困難，大部分患者明確診斷時(shí)已處晚期。近年來(lái)，生長(zhǎng)因子與腫瘤的關(guān)系備受矚目。研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor，IGF)在腫瘤細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程中起重要的調(diào)控作用，可以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中的多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，直接影響細(xì)胞的有絲分裂、分化、代謝、遷移、凋亡等。本研究探討了上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)組織中的IGF-1、IGF-1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R) 和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(insulin-like growth factor binding protein 3，IGFBP3)的表達(dá)水平及臨床意義，以期為EOC的早期診斷、治療以及預(yù)后判斷提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009—2012年在上海市第五人民醫(yī)院及江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院行手術(shù)治療的EOC患者45例，年齡33～75歲，中位年齡55歲；選取同期在這兩所醫(yī)院治療的非EOC患者25例(因子宮肌瘤等疾病而需行子宮及附件切除術(shù)的患者)，年齡25～65歲，中位年齡47歲。所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)檢查明確診斷。將術(shù)中切除的新鮮組織迅速放入液氮中保存。

1.2 試劑 Trizol試劑盒、RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒均購(gòu)自日本寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由大連寶生物工程有限公司合成。4種基因的引物序列見(jiàn)表1。

1.4 方法

1.4.1 總RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄 將50～100 mg液氮保存的新鮮組織在液氮中研磨成粉末，加入1 mL Trizol，按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。檢測(cè)提取后的總RNA的濃度和純度，取A260/A280為1.8～2.0的樣品0.8 μg，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA， 于-20 ℃保存。

1.4.2 PCR 采用20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下：IGF-1和IGF-1R為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，62 ℃ 31 s，共40個(gè)循環(huán); IGFBP3和β-actin為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共40個(gè)循環(huán)；然后再進(jìn)行熔解曲線分析。每次試驗(yàn)均設(shè)陰、陽(yáng)性及空白對(duì)照，同時(shí)進(jìn)行復(fù)孔檢測(cè)，取平均值進(jìn)行計(jì)算。

根據(jù)擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析結(jié)果，取閾值(cycle threshold，Ct)，采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平[3]。計(jì)算IGF、IGF-1R 及IGFBP3 的mRNA相對(duì)含量，公式為：目的基因mRNA/β-actin mRNA=2-(目的基因mRNA Ct-β-actin mRNA Ct)，Ct值為2次擴(kuò)增的均值，Ct值>38時(shí)判斷為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，mRNA相對(duì)表達(dá)量的數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，采用M(P25～P75)表示；多組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)；組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IGF-1、IGF-1R和IGFBP3在EOC和正常卵巢組織中的mRNA表達(dá)情況 EOC組織中IGF-1、IGF-1R和IGFBP3的 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于正常卵巢組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.2 IGF-1、IGF-1R和IGFBP3 的mRNA表達(dá)水平與EOC臨床病理學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系 IGF-1、IGF-1R和IGFBP3在EOC組織中的mRNA相對(duì)表達(dá)量在不同年齡組、不同臨床分期患者之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；這3個(gè)基因在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；這3個(gè)基因的表達(dá)與EOC組織的分化程度相關(guān)，IGF-1和IGF-1R的mRNA相對(duì)表達(dá)量隨EOC分化程度的降低而增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IGFBP3的相對(duì)表達(dá)量隨分化程度的降低而減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 IGF-1、IGF-1R和IGFBP3在上皮性卵巢癌和正常卵巢組織中的mRNA相對(duì)表達(dá)量 [M(P25～P75)，×10-3]

表3 IGF-1、IGF-1R和IGFBP3在不同類(lèi)別EOC患者中的mRNA相對(duì)表達(dá)量[M(P25～P75)，×10-3]

3 討 論

IGF具有胰島素樣的促代謝作用。IGF系統(tǒng)包括2個(gè)多肽類(lèi)生長(zhǎng)因子IGF-1、IGF-2，2類(lèi)受體IGF-1R、IGF-2R，至少6種對(duì)IGF有高親和力的IGFBP以及IGFBP蛋白酶[4]。IGF-1的編碼基因位于12號(hào)染色體，是由70個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽。IGF-1的主要功能是介導(dǎo)生長(zhǎng)激素的促生長(zhǎng)作用，且受生長(zhǎng)激素的調(diào)節(jié)，IGF-1廣泛分布于卵巢、輸卵管、子宮內(nèi)膜和胎盤(pán)等組織中。IF-1R是由2個(gè)α亞基和2個(gè)β亞基組成的四亞基糖蛋白，對(duì)細(xì)胞的正常增殖、凋亡過(guò)程以及機(jī)體的生長(zhǎng)過(guò)程具有調(diào)節(jié)作用[5]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，IGF系統(tǒng)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也起重要作用。

多種腫瘤細(xì)胞均能產(chǎn)生和分泌IGF。IGF可以作為促有絲分裂原誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)原癌基因的表達(dá)，啟動(dòng)細(xì)胞增殖分裂過(guò)程并抑制細(xì)胞凋亡[6]。研究[2]表明，IGF-1R與癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)， IGF-1和IGF-1R 在EOC組織中的mRNA水平均高于正常卵巢組織，且兩者的表達(dá)水平與腫瘤的分化程度及轉(zhuǎn)移相關(guān)。在IGF-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，IGF-1R的活性調(diào)節(jié)是一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，研究[7-8]表明，反義寡核苷酸或IGF-1R抗體均能明顯抑制IGF-1R的活性，從而抑制EOC腫瘤細(xì)胞的有絲分裂及其抵抗凋亡的能力。研究[9]發(fā)現(xiàn)，抑制IGF-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可減少腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，表明IGF-1、IGF-1R在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，IGF-1、IGF-1R信號(hào)通路的調(diào)控有望成為腫瘤治療的一個(gè)新的研究方向[10]。

IGFBP主要由肝臟合成，分布于各種組織和體液中，通過(guò)調(diào)控游離IGF的含量來(lái)調(diào)節(jié)IGF的生物活性[11]。正常人體血清中含量最高的IGFBP為IGFBP3，它能結(jié)合血清中絕大部分IGF-1，保護(hù)IGF-1不被迅速降解并將其運(yùn)輸至不同部位；可以調(diào)控IGF-1與受體之間的相互作用，從而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡。但若IGFBP3過(guò)度表達(dá)，則可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[2]。本研究發(fā)現(xiàn)， EOC中IGFBP3 mRNA 水平較正常卵巢組織顯著升高，且其升高程度與腫瘤細(xì)胞的分化程度正相關(guān)，提示IGFBP3還可通過(guò)不依賴于IGF-1的方式發(fā)揮作用，這與閆曉娟等[11]的報(bào)告相同。

IGF可以通過(guò)旁分泌和(或)自分泌方式生成，其生物學(xué)功能最終取決于IGF、IGFR和IGFBP等分子之間的綜合作用[12]。本研究表明，IGF-1、IGF-1R、IGFBP3參與了EOC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，其表達(dá)程度與腫瘤細(xì)胞的分化、轉(zhuǎn)移相關(guān)，這為深入研究EOC組織中IGF系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制提供了依據(jù)。

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