何悅 王浩 曲毅

(1.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院老年科，上海 200031； 2.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗中心，上海 200032)

大豆異黃酮(soybean isoflavone，SI)即大豆苷元，是一種從大豆中分離提取的異黃酮類化合物。研究[1]表明，SI具有廣泛的生物學(xué)作用，如雌激素樣作用、抗腫瘤、抗心律失常、抗腦缺血作用等。既往關(guān)于SI對心血管疾病作用的研究主要集中在其抗氧化活性、降血脂效應(yīng)、抑制血小板聚集效應(yīng)、血管舒張活性及防止動脈粥樣硬化和冠狀動脈硬化性心臟病惡化等方面[2]。然而，對心肌缺血再灌注模型予以SI預(yù)處理是否對心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有影響，目前鮮見報道。本研究旨在構(gòu)建大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，探討SI預(yù)處理對心肌細(xì)胞凋亡的影響及其可能的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及試劑 健康雄性SPF級SD大鼠100只，體質(zhì)量180～200 g，購自復(fù)旦大學(xué)實驗動物中心[實驗動物使用合格證號：SYXK(滬)2009-0082]，原位末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、Janus蛋白酪氨酸激酶2(Janus activated kinase 2，JAK2)、磷酸化JAK2(P-JAK2)、JAK激酶抑制劑AG490及信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)抗體均購自美國Sigma公司，SI購自湖北省宜化化工有限責(zé)任公司(純度>98%，批號：4-18)。

1.2 大鼠心肌缺血再灌注模型的構(gòu)建 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，沿胸骨左緣切開，顯露心臟，穿線結(jié)扎左冠狀動脈主干，使心肌缺血，在造模過程中連續(xù)監(jiān)測心功能指標(biāo)：左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、心率(heart rate，HR)、左心室內(nèi)壓最大變化速率(±dP/dtmax)、左心室舒張壓(left ventricular diastolic pressure，LVDP)。結(jié)扎15 min后切斷，恢復(fù)血流，再灌注90 min后處死大鼠。

1.3 實驗分組及處理 按照隨機(jī)數(shù)字表將大鼠隨機(jī)分為4組，每組25只。(1)假手術(shù)組(Sham組)：僅開胸，不結(jié)扎左冠狀動脈；(2)缺血再灌注組(I/R組)：左冠狀動脈主干結(jié)扎致缺血15 min，恢復(fù)血流，再灌注90 min；(3)SI組：缺血15 min，恢復(fù)血流，再灌注90 min，提前給予1.5% SI灌胃，10 mL/(kg·d)，連續(xù)7 d；(4)SI+JAK激酶抑制劑AG490組(SI+AG490組)：缺血15 min，恢復(fù)血流，再灌注90 min，提前用1.5% SI [10 mL/(kg·d)]和1000 μmol/L AG490[溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfo-xide，DMSO)中] 10 μL灌胃，連續(xù)7 d。取左室前壁全層心肌標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)實驗。

1.4 觀察指標(biāo) 各組均隨機(jī)抽取5只大鼠，取約125 mg心肌組織，采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測JAK2、P-JAK2、STAT3、Bcl-2、Bax蛋白(稀釋比1∶200)表達(dá)，以其與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的比值作為條帶的相對灰度值。

按照TUNEL試劑盒操作說明書的方法檢測心肌細(xì)胞的凋亡，在光學(xué)顯微鏡視野下觀察細(xì)胞，取4個視野(×100)，計數(shù)細(xì)胞數(shù)并計算細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。采用免疫組織化學(xué)法檢測心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)，并采用IPP 6.5軟件進(jìn)行圖像分析處理。

2 結(jié) 果

2.1 SI抑制心肌缺血再灌注后細(xì)胞的凋亡情況 冠狀動脈結(jié)扎后，心電圖ST段抬高45%，提示缺血再灌注模型構(gòu)建成功。TUNEL結(jié)果顯示，I/R組大鼠心肌凋亡細(xì)胞核呈綠色熒光碎片；SI組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著減少，細(xì)胞核綠色熒光碎片明顯減少。見圖1。

與Sham組比較，I/R組AI顯著升高(P<0.01)；與I/R組比較，SI組AI顯著降低(P<0.01)；與SI組比較，SI+AG490組AI顯著升高(P<0.01)。見表1。

2.2 各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá) 與Sham組比較，I/R組心肌組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；與I/R組比較，SI組心肌組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；而與SI組比較，SI+AG490組心肌組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著減少，Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。見圖2、表1。

A：Sham組；B：I/R組；C：SI組；D：SI+AG490組

A：Sham組；B：I/R組；C：SI組；D：SI+AG490組

表1 各組大鼠心肌組織中AI及Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)()

2.3 SI通過JAK-STAT通路抑制心肌細(xì)胞凋亡 各組大鼠心肌組織中JAK2蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。與Sham組比較，I/R組心肌組織中P-JAK2蛋白及STAT3蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)；與I/R組比較，SI組心肌組織中P-JAK2蛋白及STAT3蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)；與SI組比較，SI+AG490組心肌組織中P-JAK2蛋白及STAT3蛋白表達(dá)水平則顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠心肌組織中P-JAK2/JAK2、STAT3/GAPDH蛋白的表達(dá)()

3 討 論

缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)是我國發(fā)病率和病死率最高的疾病之一。冠狀動脈粥樣硬化斑塊或血栓造成的狹窄或阻塞是IHD的重要原因。對于IHD患者，及時重建心臟血供具有重要意義[3]。但缺血長達(dá)一定時間后，恢復(fù)血液供應(yīng)反而可加重心肌的損傷，主要表現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)鈣超載、細(xì)胞腫脹、心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的急劇潰變、心肌內(nèi)出血、細(xì)胞酶釋放、細(xì)胞能量代謝障礙和心臟功能的損傷[4-5]。有研究[6]發(fā)現(xiàn)，SI對壓力負(fù)荷性心肌肥厚大鼠心室重構(gòu)有明顯的改善作用，應(yīng)用SI治療后，大鼠心肌組織中血管緊張素(angiotensin Ⅰ，AngⅠ)含量顯著降低，一氧化氮含量顯著升高，心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載減輕；SI還可通過抑制Ca2+依賴性信號通路減輕或抑制大鼠心肌肥厚與纖維化。然而，應(yīng)用SI進(jìn)行缺血前處理是否能夠改善因缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷，目前尚未明確[7]。

Bcl-2家族是研究最早的凋亡基因。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中經(jīng)典的抑凋亡和促凋亡基因，兩者主要影響線粒體凋亡通路。本研究結(jié)果顯示，I/R組心肌組織中促凋亡基因Bax高表達(dá)；SI組Bcl-2蛋白表達(dá)水平高于I/R組，Bax蛋白表達(dá)水平明顯低于I/R組；這提示SI的心肌保護(hù)效應(yīng)與影響B(tài)cl-2和Bax的表達(dá)有關(guān)。Bax的易位和多聚化是細(xì)胞凋亡線粒體通路中的關(guān)鍵點，Bax的易位是凋亡的早期階段，而Bax的多聚化促進(jìn)凋亡發(fā)生不可逆改變。

我們應(yīng)用SD大鼠心肌缺血模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)SI預(yù)先處理可抑制缺血再灌注后的心肌細(xì)胞凋亡。與I/R組相比，SI組凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2上調(diào)，Bax下調(diào)，心肌凋亡數(shù)量明顯減少；而在給予JAK抑制劑AG490后，SI組喪失了對再灌注心肌的保護(hù)作用；這表明SI預(yù)先處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，并且主要通過JAK蛋白作用下游的通路實現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，與I/R組比較，SI組能顯著誘導(dǎo)P-JAK2，和STAT3蛋白表達(dá)增加，而這種作用可被JAK抑制劑AG490阻斷；這表明SI通過激活JAK通路而誘導(dǎo)P-JAK2表達(dá)增加，從而促使STAT3上調(diào)，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。研究[8-9]證明，早期再灌注損傷時，鈣超載導(dǎo)致線粒體轉(zhuǎn)換孔開放過度，使線粒體腫脹、外膜破裂，加速凋亡誘導(dǎo)因子的上調(diào)，啟動細(xì)胞的凋亡和死亡級聯(lián)反應(yīng)。有研究[10]表明，SI可使心肌細(xì)胞動作電位除極參數(shù)降低，使動作電位時程縮短；對鈣電流的抑制作用可減輕心肌細(xì)胞鈣超載，進(jìn)而保護(hù)心肌。Zhang[9]等研究均提示，JAK/STAT信號通路的激活能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡。AG490是JAK特異性抑制劑，可完全阻斷JAK下游蛋白STAT的磷酸化。研究[11]表明，AG490可明顯削弱瑞舒伐他汀所誘導(dǎo)的JAK磷酸化。本研究結(jié)果提示，SI抑制了急性心肌缺血再灌注損傷所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。其可能機(jī)制為：激活JAK，誘導(dǎo)STAT的磷酸化，進(jìn)一步下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡的數(shù)量，減輕心肌缺血再灌注造成的損傷，從而保護(hù)心肌。

綜上所述，SI對成年大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能通過以下機(jī)制實現(xiàn)。SI促使PI3K/Akt信號通路磷酸化，提高凋亡基因Bcl-2表達(dá)而減輕心肌缺血再灌注損傷，從而調(diào)節(jié)了多種與心肌缺血損傷相關(guān)的基因表達(dá)，維持了心肌再生、存活或修復(fù)的信號。其確切的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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