吳修紅，胡妮娜，李寶龍，周海純，楊恩龍，張淑香，周忠光

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040)

芍藥為傳統(tǒng)中藥，從南北朝開始分為赤、白兩種，2010版藥典收錄赤芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍 P.veitchii Lynch.的干燥根，主要為野生品;白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，多為栽培品。二者均來源于毛茛科芍藥屬植物，在生物基源上有很多共同特征，但在臨床應(yīng)用上有明顯區(qū)別，赤芍具有清熱涼血、散瘀止痛之功效;白芍則擅長于平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)。經(jīng)典方劑桂枝茯苓丸中應(yīng)用赤芍為臣藥，現(xiàn)代制劑桂枝膠囊中則使用了白芍。課題組前期采用臍中穴給藥方式明確了桂枝茯苓丸的鎮(zhèn)痛、抗炎效果［1－2］，本研究在前期研究基礎(chǔ)上［3－5］，采用臍中穴給藥方式，探討赤芍與白芍兩藥物與桂枝茯苓方劑藥理作用相關(guān)的鎮(zhèn)痛、抗炎及活血方面作用異同。

1 材料

1.1 儀器

AB265－S電子天平，梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;YLS－6A智能熱板儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)。

1.2 藥品與試劑

赤芍、白芍、桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁等藥材均購自于北京同仁堂(哈爾濱)藥店，赤芍、白芍經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)孫慧峰副教授鑒定分別為毛茛科植物芍藥P.veitchii和P.lactiflora的干燥根，其余各藥材也均為正品。

散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號131005);二磷酸腺苷二鈉(SIGMA公司，批號093K7010);AB－8型大孔吸附樹脂(南開大學(xué)化工廠)。

1.3 動物

SPF級昆明種小鼠，雌性，體重18～22 g;SPF級Wistar大鼠，雌性，體重180～220 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心提供，合格證號分別為SYXK黑2013－012、SCXK黑2013－004。

2 實驗方法

2.1 赤芍、白芍及桂枝茯苓貼膜劑制備

赤芍、白芍貼膜劑:赤芍、白芍藥材各0.5 kg，70%乙醇提取后，分別用大孔吸附樹脂精制，收集20%乙醇洗脫部位，減壓回收至無醇味后，冷凍干燥，加入基質(zhì)，分別制成貼膏劑。

桂枝茯苓貼膜劑:取桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁分別粉碎(1∶1∶1∶1∶1)，桂枝、牡丹皮提取揮發(fā)油，藥渣再與其余各藥物醇提，減壓回收、冷凍干燥成干粉，加入之前提取的揮發(fā)油，再加入基質(zhì)，制成貼膏劑。

2.2 對二甲苯所致小鼠耳廓炎癥的影響

取體重18～22 g的小鼠60只，雌性，根據(jù)體重按隨機數(shù)字表隨機分為5組，分別為空白對照組、陽性對照組(0.65 g/kg)、赤芍貼敷組(2.0 g/kg)、白芍貼敷組(2.0 g/kg)、桂枝茯苓貼敷組(4 g/kg)。將小鼠腹部用脫毛劑(非穴位組為背部)脫毛，以胸腹正中，胸骨柄上緣至外生殖器聯(lián)線上3/4與下1/4交界點為中心貼敷給藥，給藥面積6 cm2/10 g?？瞻讓φ战M貼敷同劑量的基質(zhì)，陽性對照組灌胃給予散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊(0.65 g/kg)，桂枝茯苓貼膏劑貼敷給藥組分別臍中穴貼敷給予相當(dāng)于原藥材4 g/kg體重的桂枝茯苓貼膏劑，每日給藥1次，連續(xù)7天。第7天給藥1 h后，于左耳前后兩面均勻涂抹二甲苯，右耳作空白對照。30 min后將小鼠脫頸椎處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用8 mm打孔器于同一部位打下圓耳片，稱重，以兩耳片質(zhì)量差表示炎癥程度，以組間t檢驗比較各給藥組與模型組間差異的顯著性。

2.3 對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

分組及給藥方式、給藥劑量、給藥周期同“二甲苯致小鼠耳廓炎癥反應(yīng)”的處理方法。于末次給藥1 h后，腹腔注射0.7%HAc溶液0.15 mL/10 g，觀察注射HAc后15 min內(nèi)小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)次數(shù)。

2.4 對大鼠血小板聚集的影響

健康Wistar大鼠，雌性，體重180～220 g，60只，按照隨機數(shù)字表隨機分為5組，每組12只，分組及給藥周期同“二甲苯致小鼠耳廓炎癥反應(yīng)”，給藥劑量分別為空白對照組、陽性對照組(散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊，0.45 g/kg)、赤芍貼敷組(1.4 g/kg)、白芍貼敷組(1.4 g/kg)、桂枝茯苓貼敷組(相當(dāng)于生藥2.7 g/kg)。第7天給藥結(jié)束后1 h，腹主動脈取血5 ml，枸櫞酸鈉1∶9抗凝，以500 rpm離心5 min，制備富血小板血漿(PRP)，余血漿以4000 rpm離心10 min，制備貧血小板血漿(PPP)。用PPP調(diào)PRP中血小板數(shù)為4～6×108個/mL，取各組PRP 200 μL加入比濁杯中，溫孵10 min，PPP調(diào)100%透光率，加入誘聚劑ADP(終濃度為10 μL/L)、膠原(終濃度為50 μg/mL)誘導(dǎo)，按比濁法測定最大聚集率。實驗在采血后4 h內(nèi)完成。

2.5 統(tǒng)計方法

實驗中所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行處理，均以±s表示，組間比較用t檢驗。

3 結(jié)果

3.1 對二甲苯所致小鼠耳廓炎癥的影響

與空白對照組相比，陽性對照藥散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組和桂枝茯苓貼膏劑組均有顯著性差異(P＜0.05);赤芍貼膏劑組、白芍貼膏劑組無顯著性差異，但對二甲苯所致小鼠耳廓炎癥有一定的作用趨勢，兩組之間無顯著性差異。結(jié)果見表1。

3.2 對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

與空白對照組相比，陽性對照藥散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組、赤芍貼膏劑組、白芍貼膏劑組和桂枝茯苓貼膏劑組均有顯著性差異(P＜0.05);赤芍貼膏劑組、白芍貼膏劑組和桂枝茯苓貼膏劑組組間無顯著性差異;但白芍貼膏劑組相對于赤芍貼膏劑組有作用增強趨勢，桂枝茯苓貼膏劑組無論相對于白芍還是赤芍貼膏劑組均表現(xiàn)出更強的作用趨勢。結(jié)果見表2。

表1 赤芍、白芍臍中穴給藥對二甲苯所致小鼠耳廓炎癥的影響(n=10)

表2 赤芍、白芍臍中穴給藥對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響(n=10)

3.3 對大鼠血小板聚集的影響

對ADP和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，與空白對照組相比，陽性對照藥散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組、赤芍貼膏劑組和桂枝茯苓貼膏劑組均有顯著性差異(P＜0.05);白芍貼膏劑組無顯著性差異，但呈現(xiàn)一定的作用趨勢，且對凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集作用趨勢更強。陽性對照藥散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組、赤芍貼膏劑組和桂枝茯苓貼膏劑組雖各組之間作用程度有差別，無顯著性差異。結(jié)果見表3。

表3 赤芍、白芍臍中穴給藥對大鼠血小板聚集活性的影響(n=10)

4 討論

赤芍與白芍在臨床應(yīng)用較多，赤芍更擅長活血、涼血，而白芍則側(cè)重于止痛、補血。王瑞等［6］研究顯示白芍和赤芍不同提取物對于炎性水腫與炎性滲出均有不同程度的治療效果，本研究中赤芍和白芍貼膏劑也顯示有一定程度的抗炎作用趨勢，但差異無顯著性;由赤芍組成的桂枝茯苓貼膏劑抗炎作用則呈顯著性差異。赤芍貼膏劑、白芍貼膏劑、桂枝茯苓貼膏劑3組均有不同程度的止痛作用，3組作用強度上桂枝茯苓貼膏劑組最強、白芍貼膏劑組次之，但強度差別無統(tǒng)計學(xué)意義。赤芍貼膏劑對ADP和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集有抑制作用，與赤芍的活血作用［7］相一致，差異具顯著性;桂枝茯苓貼膏劑組也呈現(xiàn)相同作用，且作用強度有增強趨勢;白芍貼膏劑組則無此作用。研究中赤芍及白芍的抗炎作用無顯著性差異是否由于給藥途徑改變引起作用差異，需進一步實驗驗證。

桂枝茯苓方劑由桂枝、茯苓、丹皮、桃仁、芍藥組成，具有溫經(jīng)通絡(luò)、緩消癥塊之功，對血瘀引起的痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥等具有較好的治療效果。研究結(jié)果證明桂枝茯苓貼膏劑具有抗炎、鎮(zhèn)痛和活血化瘀作用，作用強度相對于赤芍單味藥物臍中穴給藥具有增強趨勢;同時赤芍與白芍相比，赤芍與桂枝茯苓貼膏劑作用更一致，一方面驗證了中醫(yī)方劑用藥的科學(xué)性，另一方面也驗證了桂枝茯苓方劑由赤芍組成的合理性。

［1］吳修紅，李寶龍，楊恩龍，等.桂枝茯苓貼膏劑臍中穴給藥的鎮(zhèn)痛、抗炎作用研究［J］.針灸臨床雜志，2014，30(2):65 －68

［2］吳修紅，劉麗佳，王喜軍.桂枝茯苓丸及組成中藥化學(xué)成分研究進展［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2010，38(6):102 －105

［3］孫麗梅，周忠光，郭建敏，等.不同促透劑對脂溶性基質(zhì)制劑臍中穴經(jīng)皮給藥作用研究［J］.中醫(yī)藥信息，2010，27(1):20－22

［4］田明，周忠光，胡鵬，等.透皮促進劑對水溶性基質(zhì)制劑臍中穴經(jīng)皮給藥作用研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2010，38(2):94 －96

［5］田明，周忠光，范越，等.臍療法的藥劑學(xué)研究進展［J］.中醫(yī)藥信息，2008，25(4):9 －12

［6］王瑞，魯嵐，李穎偉，等.赤芍與白芍的藥理作用比較［J］.中國實驗方劑學(xué)，2010，16(7):112 －114

［7］Jin Songnan，Wen Jinfu，Wang Tingting，et al.Vasodilatory effects of ethanol extract of Radix Paeoniae Rubra and its mechanism of action in the rat aorta［J］.J Ethnopharmacol，2012，142(1):188 － 193