陳東來(lái) 張福全 桑永華 朱蓉英 張洪濤 陳勇兵

細(xì)胞的凋亡抑制在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis, XIAP）相關(guān)因子1（XAF1）是新鑒定的腫瘤抑制基因，在許多腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞株中低表達(dá)甚至不表達(dá)[2]。新近研究[3,4]發(fā)現(xiàn)，XAF1在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞、肺鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性。但對(duì)肺腺癌細(xì)胞作用如何尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以重組腺病毒為載體，研究過(guò)表達(dá)XAF1基因?qū)θ朔蜗侔┘?xì)胞A549的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制，為腺病毒介導(dǎo)XAF1基因治療肺腺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司；甲基噻唑基四唑（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自Sigma公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司；RIPA裂解液購(gòu)自上海申能博彩公司；XAF1抗體購(gòu)自Abcam公司；PARP、Caspase-3和Caspase-8抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體購(gòu)自Sigma公司；RNA提取試劑盒和辣根過(guò)氧化物酶連接的二抗購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光熒光試劑ECL購(gòu)自Amersham bioscience公司；XAF1和β-actin引物由上海生工生物公司合成，以β-actin為內(nèi)參照。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，為貼壁細(xì)胞，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）培養(yǎng)和傳代（37oC、5%CO2）。

1.3 重組腺病毒 Ad5/F35-XAF1和對(duì)照空病毒Ad5/F35-Null由北京本元正陽(yáng)公司合成與擴(kuò)增，轉(zhuǎn)染滴度分別0.69×1010PFU/mL和1.26×1010PFU/mL。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR） 采用試劑盒抽取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度，并逆轉(zhuǎn)成cDNA。XAF1引物上游：5’-TCCGCAATTCATGCTCCACGAGTCCTA CTG-3’，下游：5’-ACGCGTCGACAAACTCTGAGTCTG GACAAC-3’，產(chǎn)物大小260 bp。內(nèi)參照β-actin引物上游：5’-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGC-3’，下游：5’-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3’，產(chǎn)物大小830 bp。PCR反應(yīng)條件：95oC、3 min；94oC、45 s，57oC、45 s，72oC、45 s，共30個(gè)循環(huán)。最后72oC延伸6 min。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，100伏電壓30 min電泳后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照和分析。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549原代肺腺癌細(xì)胞以5,000個(gè)/孔接種在96孔板上，24 h后，用無(wú)血清RPMI-1640稀釋重組腺病毒Ad5/F35-NULL和Ad5/F35-XAF1，分別按MOI（50、100、200）加入96孔板中轉(zhuǎn)染細(xì)胞，空白對(duì)照組不加任何病毒處理，置于37oC、5%CO2溫箱孵育4 h后置換為含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，棄去上清，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，在培養(yǎng)箱孵育4 h，小心吸凈MTT液，后加入二甲基亞砜（DMSO）150 mL/孔， 避光搖床上放置10 min，于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度（A）值，細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)孔A值-空白對(duì)照孔A值）/對(duì)照孔A值×100%。各滴度梯度組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 Annexin V-FITC/PI雙染法（流式細(xì)胞儀法） 將A549原代肺腺癌細(xì)胞以2×105/孔密度接種于6孔板中，按MOI 100的濃度分別加入Ad5/F35-NULL和Ad5/F35-XAF1（方法同5）。轉(zhuǎn)染4 h后加入含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，繼續(xù)37oC溫箱孵育48 h后制成細(xì)胞懸液。加入Annexin V-FITC和PI染色液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，每組重復(fù)3次，取平均值。

1.7 Western blot檢測(cè)XAF1及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 用RIPA細(xì)胞裂解液抽取細(xì)胞總蛋白，并用BCA方法測(cè)蛋白濃度，取50 μg蛋白質(zhì)，加1/4蛋白量的5×蛋白上樣緩沖液，配置10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）并上樣，依次進(jìn)行蛋白垂直電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉，分別加入特異性β-actin抗體（1:5,000）和XAF1抗體（1:1,000）以及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3抗體（1:1,000）、Caspase-8（1:1,000）、PARP抗體（1:1,000），4oC孵育過(guò)夜，用TBS/T洗膜后分別加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫?fù)u床2 h，ECL顯像，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照并分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人肺腺癌細(xì)胞株A549中XAF1 mRNA和蛋白的表達(dá) Ad5/F35-XAF1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后，行PCR和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與Ad5/F35-NULL轉(zhuǎn)染組相比，A549細(xì)胞中XAF1 mRNA和蛋白表達(dá)在Ad5/F35-XAF1轉(zhuǎn)染48 h后明顯增高（圖1）。

2.2 細(xì)胞增殖率情況 將A549原代細(xì)胞、轉(zhuǎn)染Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-NULL三組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，MTT法提示肺腺癌A549細(xì)胞增殖率隨著Ad5/F35-XAF1 MOI的升高而降低，當(dāng)MOI為100和200時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率分別為19%和52%，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Ad5/F35-NULL 48 h后，各MOI組細(xì)胞增殖率無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且MOI為100和200時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率分別為3%和10.5%，Ad5/F35-XAF1組細(xì)胞增殖抑制率明顯低于相應(yīng)Ad5/F35-NULL組（P＜0.05），其中轉(zhuǎn)染Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-NULL兩組A549細(xì)胞增殖抑制率測(cè)算均以A549原代細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)（圖2）。

2.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)情況 將A549原代細(xì)胞、轉(zhuǎn)染Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-NULL三組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，Annexin V-FITC/PI雙染法于流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果顯示，A549原代細(xì)胞、Ad5/F35-NULL及Ad5/F35-XAF1三組中A549細(xì)胞早期凋亡率分別為3.2%、6%和15%。與Ad5/F35-NULL及A549原代細(xì)胞兩組相比，Ad5/F35-XAF1轉(zhuǎn)染組中A549細(xì)胞早期凋亡率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

2.4 凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-NULL分別轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細(xì)胞48 h后，用Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。與對(duì)照病毒相比，Ad5/F35-XAF1組的A549細(xì)胞中PARP、Caspase-3和Caspase-8蛋白出現(xiàn)明顯裂解條帶，顯示Caspase依賴途徑的凋亡通路活化（圖4）。

3 討論

XAF1是運(yùn)用酵母雜交法發(fā)現(xiàn)的一種新型XIAP拮抗蛋白，可直接與XIAP結(jié)合并抑制其抗凋亡作用[5,6]，并發(fā)現(xiàn)XAF1對(duì)凋亡抑制家族IAPs家族有普遍的抑制作用[7]。本課題組已有的研究[4]表明，XAF1在人肺鱗癌組織中的表達(dá)明顯低于正常肺組織，且XAF1低表達(dá)的程度與肺鱗癌患者的腫瘤分期、病理分級(jí)、腫瘤浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切。其他研究也發(fā)現(xiàn)，通過(guò)腺病毒介導(dǎo)的XAF1能恢復(fù)XAF1基因在胃癌[3]、結(jié)腸癌[8]等消化系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)甚至過(guò)表達(dá)，且能抑制細(xì)胞增殖促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

作為重要的腫瘤抑制因子之一，XAF1在人食管癌[9]、肺癌[4]、胃腸癌[10]等多種腫瘤組織中的表達(dá)明顯低于正常組織，且與腫瘤的分期、分級(jí)相關(guān)，但其在肺腺癌A549中抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制尚不明確。本研究以重組腺病毒為載體，恢復(fù)XAF1基因在肺腺癌A549細(xì)胞中的表達(dá)，用PCR及Western blot方法均提示XAF1表達(dá)明顯增加，而對(duì)照病毒Ad5/F35-NULL組中XAF1表達(dá)低下（圖1）。用MTT法檢測(cè)Ad5/F35-XAF1對(duì)A549細(xì)胞活力的影響，結(jié)果提示Ad5/F35-XAF1組中其細(xì)胞活力較相同MOI值的對(duì)照空病毒Ad5/F35-NULL明顯降低（圖2）。流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示，恢復(fù)XAF1在A549細(xì)胞中的表達(dá)后可明顯誘導(dǎo)該腫瘤細(xì)胞凋亡（圖3）并且凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-8和PARP的裂解條帶明顯增加（圖4），表明XAF1基因誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的途徑主要通過(guò)Caspase依賴的凋亡信號(hào)通路。Liston等[11]研究發(fā)現(xiàn)，XAF1與XIAP結(jié)合后定位于細(xì)胞核，它通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制XIAP對(duì)Caspase-3抑制作用以激活Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9的活性，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，我們的研究證實(shí)了他的部分研究結(jié)果。

圖1 重組腺病毒感染后A549細(xì)胞中XAF1 mRNA（A）和蛋白（B）的表達(dá)明顯增強(qiáng)Fig 1 After infecting by recombinant adenovirus, the expression of mRNA (A) and protein (B) of XAF1 gene increased significantly in A549 cell line

圖2 XAF1高表達(dá)明顯抑制了A549細(xì)胞的增殖Fig 2 The higer expression of XAF1 gene inhibited A549 cell proliferation significantly

圖3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡率。A：原始圖；B：統(tǒng)計(jì)柱狀圖。Ad5/F35-XAFl轉(zhuǎn)染組中A549細(xì)胞早期凋亡率明顯增高。Fig 3 Apoptosis rate of A549 detected with Annexin V-FITC/PI staining method. A: Raw data; B: Statistical histogram. Early stage apoptosis rate of A549 cell line increased significantly in the Ad5/F35-XAF1 transfected group.

圖4 肺癌A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)（蛋白質(zhì)印記法）Fig 4 The expression of apoptosis related proteins in human lung cancer cell line A549

綜上所述，恢復(fù)XAF1基因在肺腺癌A549細(xì)胞中的表達(dá)，可明顯抑制該腫瘤細(xì)胞的增殖，并可明顯誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與其激活Caspase凋亡信號(hào)通路有關(guān)，XAF1基因有望成為治療肺癌的新靶點(diǎn)。