,3 ,2,4* ,2

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410007;4.國(guó)家中醫(yī)藥管局中藥藥性與藥效實(shí)驗(yàn)室三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208

婦科千金片對(duì)大鼠慢性盆腔炎模型輸卵管組織Caspase-3和Caspase-8表達(dá)的影響

聶晶1李鑫1,3師振予1,2,4*郭建生1,2

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410007;4.國(guó)家中醫(yī)藥管局中藥藥性與藥效實(shí)驗(yàn)室三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208

目的通過(guò)觀察婦科千金片對(duì)SD大鼠慢性盆腔炎模型中輸卵管組織Caspase-3蛋白和Caspase-8蛋白表達(dá)影響，深入探討婦科千金片治療慢性盆腔炎的作用機(jī)制。方法采用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及解脲脲原體混合菌接種法，建立慢性盆腔炎模型，隨機(jī)分成七組：空白組，模型組，假手術(shù)組，中藥婦炎康(0.41g·kg-1)對(duì)照組，和婦科千金片低劑量組(0.52g·kg-1)、中劑量組(1.04g·kg-1)、高劑量組(2.08g·kg-1)。經(jīng)藥物治療后，解剖大鼠取輸卵管組織，運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察Caspase-3蛋白和Caspase-8蛋白表達(dá)情況。結(jié)果治療21d后，與模型組比，婦科千金片低劑量組Caspase-3蛋白光密度值升高，具有明顯差異(P<0.05)，婦科千金片中、高劑量Caspase-3蛋白光密度值明顯升高，具有顯著性差異(P<0.01)；與模型組比，婦科千金片低、中、高劑量Caspase-8蛋白光密度值明顯升高，具有顯著性差異(P<0.01)。結(jié)論婦科千金片可能通過(guò)升高Caspase-3蛋白和Caspase-8蛋白的表達(dá)，引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使炎性細(xì)胞凋亡，從而減輕輸卵管組織炎性損害。

婦科千金片；慢性盆腔炎；半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3；半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-8

盆腔炎(Pelvic Inflammatory Disease, PID)是指女性生殖器官以及其周圍結(jié)締組織、盆腔腹膜發(fā)生的炎癥，臨床上根據(jù)其危急程度和進(jìn)展分為急性盆腔炎和慢性盆腔炎。慢性盆腔炎(Chronic Pelvic Inflammatory Disease，CPID)主要包括慢性輸卵管炎與輸卵管積水、輸卵管卵巢炎及輸卵管卵巢囊腫、慢性盆腔結(jié)締組織炎[1]。因CPID反復(fù)發(fā)作，經(jīng)久不愈，病情遷移，導(dǎo)致不孕不育、盆腔黏連性疾病等后果嚴(yán)重，其治療是一個(gè)很棘手的問(wèn)題。婦科千金片在臨床中使用廣泛，對(duì)急慢性盆腔炎、子宮內(nèi)膜炎等婦科常見病具有顯著療效[2-3]。我們前期研究，發(fā)現(xiàn)婦科千金片對(duì)急性盆腔炎大鼠通過(guò)調(diào)節(jié)免疫球蛋白，提高機(jī)體免疫能力[4]，保護(hù)大鼠子宮、輸卵管、卵巢等盆腔組織[5]，還可以通過(guò)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)，降低大鼠子宮、輸卵管組織IL-6mRNA、NF-κB蛋白，發(fā)揮抗炎免疫作用[6-7]。本研究擬觀察婦科千金片對(duì)大鼠慢性盆腔炎模型輸卵管組織Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)影響，進(jìn)一步驗(yàn)證婦科千金片在治療慢性盆腔炎方面的療效并探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 雌性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自長(zhǎng)沙斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2009-0004。

1.2 主要儀器 JY3002型電子天平；Shandon325型石蠟切片機(jī)；Motic B5顯微攝像系統(tǒng)等。

1.3 藥品及主要試劑 婦科千金片：株洲千金藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20110901；婦炎康片：湖南湘泉制藥有限公司，批號(hào)111105。Caspase-3免疫組化試劑盒，caspase-8免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.4 菌株 大腸桿菌(Escherichia coli，菌種號(hào)26002)，金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus，菌種號(hào)44152)，解脲脲原體(M.urealyticum，菌種號(hào)52011)，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)免疫與微生物教研室伍參榮教授惠贈(zèng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 慢性盆腔炎模型制備 參考文獻(xiàn)方法[8-9]，用注射器分別抽取等體積的濃度為1×109CFU的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和解脲脲原體菌液，注入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，混合均勻。將醫(yī)用明膠片剪成大小0.5cm×0.5cm的方塊，置于混合菌液中，使其充分接觸。明膠充分飽和后，左手持鼠尾，將大鼠倒立，右手夾含混合菌液的明膠塊經(jīng)陰道塞至宮腔內(nèi)，左右各1塊，并保持大鼠倒立1～2min。隔天1次，連續(xù)4次。假手術(shù)組塞入不含菌液的明膠塊。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 將成功建立的模型組大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為7組，每組10只。婦科千金片組高、中、低劑量分別按2.08，1.04和0.52 g·kg-1ig給予相應(yīng)濃度的藥液，婦炎康組按0.41g·kg-1給予婦炎康藥液，空白對(duì)照組、假手術(shù)組及模型組分別給予等容積蒸餾水，ig給藥，1次·d-1，連續(xù)21d。

2.3 大鼠慢性盆腔炎模型輸卵管組織中Caspase-3和Caspase-8表達(dá)情況測(cè)定 解剖大鼠，取大鼠輸卵管組織，用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。利用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)輸卵管組織Caspase-3和Caspase-8表達(dá)情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)均以表示，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布，采用單因素方差分析；呈非正態(tài)分布，則采用秩和檢驗(yàn)。(P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。

3 結(jié)果

婦科千金片對(duì)大鼠慢性盆腔炎模型輸卵管組織Caspase-3和Caspase-8表達(dá)情況與空白組比較，模型組大鼠輸卵管組織Caspase-3蛋白表達(dá)有顯著性差異(P<0.01)。經(jīng)婦科千金片治療后，與模型組相比，婦科千金片低劑量Caspase-3蛋白有顯著性升高(P<0.05)，婦科千金片中、高劑量組Caspase-3蛋白的表達(dá)也有顯著性升高(P<0.01)。

與空白組比較，模型組大鼠輸卵管組織Caspase-8蛋白表達(dá)有顯著性差異(P<0.01)。經(jīng)婦科千金片治療后，與模型組相比，婦科千金片低、中、高劑量組Caspase-8蛋白的表達(dá)有顯著性升高(P<0.01)。見表1。

表1 婦科千金片對(duì)caspase-3蛋白和caspase-8蛋白光密度的影響

注：與空白組相比▲P<0.05,▲▲P<0.01；與模型組相比★P<0.05,★★P<0.01

4 討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在組織損傷過(guò)程中巨噬細(xì)胞識(shí)別吞噬中性粒細(xì)胞，避免炎癥反應(yīng)發(fā)生，半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific protease，caspase)在其細(xì)胞凋亡過(guò)程中有重要意義。其中Caspase-3、8蛋白的表達(dá)有促進(jìn)凋亡作用，Caspase-3、8蛋白觸發(fā)炎癥細(xì)胞凋亡是促進(jìn)炎癥恢復(fù)的機(jī)制之一。李華等[10]發(fā)現(xiàn)，手術(shù)組大鼠脊髓全橫斷損傷后脊髓灰質(zhì)白質(zhì)均檢測(cè)到凋亡細(xì)胞，Caspase-3在損傷周圍組織呈陽(yáng)性，同時(shí)對(duì)比手術(shù)組Caspase-3表達(dá)顯著高于假術(shù)組。在慢性炎癥由發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中T細(xì)胞的活化發(fā)揮重要作用，而Caspase-8是T細(xì)胞的活化中重要因子。T細(xì)胞活化過(guò)程中檢測(cè)到多種Caspases活性。Alam[11]用抗CD3抗體刺激人外周血單核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Caspase-8被活化，同時(shí)還檢測(cè)到其下游的Caspase-3的活性。在本研究中，在空白組輸卵管組織中Caspase-3、8蛋白的光密度最低，提示Caspase-3、8蛋白在正常組織中含量較少。慢性盆腔炎模型組織中Caspase-3、8蛋白的光密度值明顯高于空白組，具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，證明Caspase-3、-8蛋白在炎癥反應(yīng)中其表達(dá)上調(diào)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。婦科千金片治療后，與模型組比，婦科千金片低、中、高劑量組Caspase-3、Caspase-8蛋白光密度值明顯升高，具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，證明婦科千金片可以促進(jìn)Caspase-3、Caspase-8蛋白的表達(dá)。慢性炎癥由活化的T細(xì)胞介導(dǎo)，提示在慢性盆腔炎模型中，婦科千金片可能通過(guò)活化T細(xì)胞，TNF與TNFR-1結(jié)合，下傳凋亡信號(hào)，進(jìn)而激活Caspase-8再活化Caspase-3,引起Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)。通過(guò)此途徑激發(fā)炎性細(xì)胞凋亡，使慢性炎癥吸收消散，減輕輸卵管組織炎性損傷，促進(jìn)輸卵管炎癥恢復(fù)。

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TheinfluenceofFukeQianjinTabletstorat’sCaspase-3andCaspase-8expressionofthefallopiantubeswithchronicpelvicinflammatorydisease

NIE Jing1，LI Xin1,3，SHI Zhenyu1,2,4*， GUO Jiansheng1,2

1. Key Laboratory of Modernization of Chinese Medicine，Hunan University of Chinese Medicine , Chang sha 410208 ,China；2.Shools of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine , Chang sha 410208 ,China；3. Institute of Traditional Chinese Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Chang sha 410007, China

Objective To study the influence of FukeQianjin Tablets to rat’s Caspase-3 、Caspase-8 expression of the fallopian tubes with chronic pelvic inflammatory disease. Method The rats were established by mixed bacteria of Escherichia coli ,Staphyloccocusaureus and M.urealyticum. The rats were randomly divided into 7 groups :the control group, the model group，the low dosage group, the middle dosage group and the high dosage group of FukeQianjin Tablets, Fuyankang group. FukeQianjin Tablets in high, middle and low dosage were used to treat chronic pelvic inflammation model rat for 21days. Takes rat’s the fallopian tubes , the expression of caspases-3 and caspases-8 was detected by immunocytochemistry. Results After 21 days, Compared with model group, the expression of caspases-3: the FukeQianjin Tablets in low dosage groups were higher than in model group(P<0.05)，the FukeQianjin Tablets in middle and high dosage groups were markedly higher than in model group(P<0.01); the expression of caspases-8 :the FukeQianjin Tablets groups were markedly higher than in model groups(P<0.01)Conclusion FukeQianjin Tablets may improve the expression of caspases-3、caspases-8, produce Caspase cascade, make inflammatory cells to apoptosis, relieve ovarian tissue inflammatory pathological damage eventually.

FukeQianjin Tablets;； chronic pelvic inflammatory disease； caspase-3 ；caspase-8

湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)開放基金(10K045)。

聶晶，女，碩士，E-Mail:niejing2007521@sina.com。

師振予，女，博士，講師，E-mail:helenszy@hotmail.com。

R285.6

A

1007-8517(2014)09-0008-03

2014.03.09)