桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 桂林 541001

正骨洗劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

蔡小玲秦貽強(qiáng)陳越

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 桂林 541001

目的建立正骨洗劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法用薄層色譜法定性鑒別制劑中的牡丹皮、防風(fēng)、當(dāng)歸、續(xù)斷，用高效液相色譜法測(cè)定制劑中丹皮酚的含量。結(jié)果TLC法可鑒別制劑中的牡丹皮、防風(fēng)、當(dāng)歸、續(xù)斷；HPLC法定量測(cè)定丹皮酚在0.043～0.428μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為r=0.9999，平均回收率為99.22%，RSD=0.70%。結(jié)論本法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，可作為本品重要的質(zhì)量控制指標(biāo)。

正骨洗劑；TLC；HPLC；丹皮酚

正骨洗劑是我院骨外科的中藥驗(yàn)方，由牡丹皮、防風(fēng)、當(dāng)歸、續(xù)斷等11味中藥提取精制而成。多年的臨床應(yīng)用研究證實(shí)，該洗劑具有舒筋活絡(luò)，消腫止痛，活血祛瘀的功效，用于跌打扭傷、各種骨折、關(guān)節(jié)腫痛、脫臼、軟組織損傷、瘀血等具良好效果；并對(duì)風(fēng)濕骨痛具有較好的防治效果。本課題組對(duì)本洗劑進(jìn)行深入研究，開發(fā)成醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥民族藥正骨洗劑，不僅能使住院病患及時(shí)方便地用藥，也為門診患者提供優(yōu)良的便于攜帶、使用的中成藥制劑，發(fā)揮中醫(yī)藥在風(fēng)濕骨傷方面的優(yōu)勢(shì)作用。為了控制本品質(zhì)量、確保其臨床療效，本文對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，采用薄層色譜法[1]建立了牡丹皮、防風(fēng)、當(dāng)歸、續(xù)斷的薄層色譜鑒別，并對(duì)制劑中牡丹皮的主要活性成分丹皮酚進(jìn)行含量測(cè)定[2-4]，本法操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

日本島津AEL2-200型電子天平；日本島津LC-20AT型HPLC儀；威瑪龍色譜工作站。丹皮酚對(duì)照品(批號(hào)：0708-9704，中國藥品生物制品檢定所)；牡丹皮對(duì)照藥材、防風(fēng)對(duì)照藥材、當(dāng)歸對(duì)照藥材、續(xù)斷對(duì)照藥材均有中國藥品生物制品檢定所提供；正骨洗劑及各陰性樣品均由桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供。甲醇為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 牡丹皮的鑒別 牡丹皮主要成分有酚類及酚苷類、單萜及單萜苷類、三萜、甾醇及其苷類、黃酮、有機(jī)酸、香豆素等[5]，其中丹皮酚等主要有效成分易溶于低極性的有機(jī)溶劑，故采用乙醚作為提取溶劑。取本品20ml，加入乙醚充分振搖，提取2次，每次20ml，合并乙醚提取溶液，揮干，殘?jiān)尤氡?ml使其溶解，作為供試品溶液。另取牡丹皮對(duì)照藥材1g，加乙醚10ml，超聲處理10min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)尤氡?ml使其溶解，制成對(duì)照藥材溶液。再取丹皮酚對(duì)照品適量，加丙酮制成每1ml含1mg的對(duì)照品溶液。吸取上述三種溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰乙酸(4∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出晾干，噴以2%香草醛硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。見圖1。

2.1.2 防風(fēng)的鑒別 防風(fēng)主要含揮發(fā)油、色原酮類、香豆素類、多糖類等成分[6]。其中其主要成分多能溶于丙酮，故采用丙酮為溶劑。將供試品蒸干用丙酮溶解作為供試品溶液，對(duì)照藥材用丙酮超聲提取，經(jīng)試驗(yàn)以硅膠G薄層板，三氯甲烷-甲醇 (4∶1)為展開劑，展開，置紫外光燈(365mn)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾。見圖2A。

2.1.3 當(dāng)歸的鑒別 當(dāng)歸的主要有效成分揮發(fā)油及有機(jī)酸均易溶于極性低的有機(jī)溶劑。經(jīng)試用乙醚，乙酸乙酯及三氯甲烷等提取，結(jié)果以乙醚提取效果最好。取本品20ml，加入乙醚充分振搖，提取2次，每次20ml，合并乙醚提取溶液，揮干，殘?jiān)蛹状?ml使其溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對(duì)照藥材1g，加入乙醚10ml，超聲處理10min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。吸取上述二種溶液各10ml，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(8.5 ∶1.5)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365mn)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾。見圖2B。

2.1.4 續(xù)斷的鑒別 續(xù)斷主要含環(huán)烯醚萜糖苷及揮發(fā)油。糖苷類易溶于正丁醇，故供試品溶液采用水飽和正丁醇溶液振搖提取。取本品20ml，加入水飽和正丁醇溶液充分振搖，提取2次，每次20ml，合并正丁醇溶液提取溶液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使其溶解，作為供試品溶液。另取續(xù)斷對(duì)照藥材1g，加甲醇10ml，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使其溶解，作為對(duì)照藥材溶液。吸取上述三種溶液各10ml，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正丁醇-乙酸-水(4∶1∶5)上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。見圖2C。

1，2，3樣品(sample) 4對(duì)照藥材(reference crude herb) 5對(duì)照品(reference) 6陰性樣品(negative sample)

防風(fēng) 當(dāng)歸 續(xù)斷1，2，3樣品(sample) 4 對(duì)照藥材(reference crude herb) 5 陰性樣品(negative sample)

2.2 丹皮酚的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Shim-pack VP-ODS色譜柱(4.6 mm×150 mm，5μm)，流動(dòng)相：甲醇-水(60 ∶40)；檢測(cè)波長(zhǎng)：274 nm；柱溫：室溫，進(jìn)樣量為10μl。理論板數(shù)按丹皮酚峰計(jì)算，不低于2000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹皮酚對(duì)照品適量，加80%甲醇溶液制成每1ml含20μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取本品10ml，置50ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理(功率250W，頻率33kHz)15min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 取缺牡丹皮的陰性樣品，照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密吸取丹皮酚對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10μl，注入HPLC儀，記錄色譜圖，結(jié)果在陰性樣品色譜圖中，在丹皮酚出峰位置沒有吸收峰，表明陰性樣品對(duì)測(cè)定無干擾，在供試品色譜圖中，丹皮酚與相臨峰分離度>1.5，理論塔板數(shù)符合要求。對(duì)照品、樣品和陰性樣品溶液的色譜見圖3。

A 對(duì)照品 B 樣品 C 陰性樣品

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密量取濃度為42.8μg·ml-1的丹皮酚80%甲醇的對(duì)照品溶液1、2、3、5、10 ml，分別置10 ml量瓶中，加80%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，分別作為對(duì)照品溶液(濃度分別為4.28、8.56、12.84、21.40、42.80μg·mL-1)。按上述的色譜條件分別進(jìn)樣10μl，測(cè)定。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為： Y=4.149×106X - 6.013×103(r=0.999 9)，結(jié)果表明：丹皮酚在 0.043～0.428μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 對(duì)同一對(duì)照品溶液，連續(xù)測(cè)定6次，6次測(cè)定峰面積的RSD=0.67%，試驗(yàn)表明，儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)同一供試品(20130201)平行測(cè)定6份，6份測(cè)定結(jié)果的平均值為104.6μg·mL-1，RSD =0.61%(n=6)。結(jié)果表明，本法的重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 制備同一供試品溶液后，以0、1、2、4、6、8、12 h分別精密吸取10μl測(cè)定一次，峰面積積分值RSD=0.92%。試驗(yàn)表明，在12h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知丹皮酚含量為104.6μg·ml-1的供試品5 ml，置50 ml量瓶中，平行取6份樣，分別精密加入5 ml水和10 ml濃度為53.6μg·ml-1的丹皮酚對(duì)照品甲醇溶液，加甲醇適量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)15min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，取上清液，濾過，取續(xù)濾液測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為99.22%，RSD =0.70%(n=6)，符合定量分析的要求。

2.2.11 樣品測(cè)定 按上述的含量測(cè)定方法，測(cè)定了本品5批樣品中的丹皮酚含量，結(jié)果5批樣品平均含量91.2μg·ml-1，含量最高為110.5μg·ml[-1]，最低74.2μg·ml-1。

3 討論

3.1 通過對(duì)正骨洗劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)研究，建立牡丹皮、防風(fēng)、當(dāng)歸、續(xù)斷等4個(gè)專屬性強(qiáng)的薄層色譜鑒別。對(duì)處方中紅花、桂枝等進(jìn)行了鑒別研究，色譜斑點(diǎn)清晰，結(jié)果因重現(xiàn)性較差，未收入標(biāo)準(zhǔn)。另外對(duì)川芎、沒藥等進(jìn)行了鑒別研究，結(jié)果色譜斑點(diǎn)清晰，但陰性有干擾，未收入標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 本品為洗劑，水為溶劑，在含量測(cè)定供試液制備過程中，曾試驗(yàn)用乙醚對(duì)供試品進(jìn)行萃取，乙醚揮干用甲醇溶解作為供試品溶液，相對(duì)于本法采用的供試品溶液制備方法具有去除雜質(zhì)效果更好的優(yōu)點(diǎn)，但本法采用的方法更簡(jiǎn)便、避免了萃取的繁雜操作和多次萃取及轉(zhuǎn)移可能帶來的誤差，并且色譜圖中丹皮酚和相臨雜峰分離良好，無干擾，符合定量分析的要求。

3.3 復(fù)方中藥制劑的質(zhì)量控制是一個(gè)系統(tǒng)的評(píng)價(jià)過程，建立全面的TLC鑒別和適當(dāng)?shù)暮繙y(cè)定方法，能夠較全面地控制復(fù)方中藥制劑的質(zhì)量[7]。

[1] 高冠喜，董宙．中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化與中藥現(xiàn)代化發(fā)展的探討[J]．中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，30(2)：76-77．

[2] 孫瑛蔚，徐芝育．高效液相色譜法測(cè)定蒲黃止血口服液中丹皮酚的含量[J]．吉林中醫(yī)藥，2010，30(2)：172．

[3] 劉智生，李嘉，黃建猷． 乳康酊的薄層鑒別及丹皮酚的含量測(cè)定[J]．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(2)：50-52．

[4] 吳振宇，王書婷，蔣英，等．HPLC法對(duì)舒新片中丹皮酚的含量測(cè)定[J]．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12(30)：5930-5932．

[5] 王祝舉，唐力英，赫炎．牡丹皮的化學(xué)成分和藥理作用[J]．國外醫(yī)藥：植物藥分冊(cè)，2006，21(4)：155-159．

[6] 竇紅霞，高玉蘭．防風(fēng)的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J]．中醫(yī)藥信息，2009，26(2)：15-17．

[7] 王崢濤．中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展與展望[J]．中國天然藥物，2006，4(6)：404-409．

ResearchonthemethodofcontrolingqualityinBonesettingLotion

CAI Xiao-ling QIN Yi-qiang CHEN Yue

Department of Pharmacology, The Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541004，China

ObjectiveTo establish the standard of quality for Bone setting Lotion.MethodsTLC was adopted to identify Cortex moutan Radicis,Radix sileris,Angelica and Radix Dipsaci, and HPLC was adopted to determine the content of paeonol in Bone setting Lotion.ResultsCortex moutan Radicis,Radix sileris,Angelica and Radix Dipsaci could be identified by TLC. The linear range of Paeonol was 0.043～0.428 mg(r=0.999 9),the average recovery was 99.22%,RSD=0.70%.ConclusionThe method is simple,accurate, It is suitable for quality control of Bone setting Lotion.

Bone setting Lotion; TLC;HPLC; paeonol

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(xiàng)(GZYZ1226)。

蔡小玲，副主任藥師，主要從事中藥制劑研究。E-mail：516442235@qq.com

R284.1

A

1007-8517(2014)14-0013-03

2014.05.27)