廣東省醫(yī)學實驗動物中心，廣東 佛山 528248

菲牛蛭提取物對順鉑治療S180荷瘤鼠減毒作用的研究

黃紅坤王諾王弋黃小紅劉盛來孫俠林小婷任海濤鄺少松*

廣東省醫(yī)學實驗動物中心，廣東 佛山 528248

目的研究菲牛蛭提取物聯(lián)合順鉑治療S180荷瘤鼠效果及其減毒作用。方法建立S180荷瘤鼠模型10天后，將40只BALB/c小鼠按腫瘤體積隨機分為陰性對照組、順鉑組、菲牛蛭提取物組、菲牛蛭提取物+順鉑組。分組后開始給藥，連續(xù)給藥7天，第8天處死各組小鼠，取血清檢測肝腎功能指標；取腎臟進行組織病理學檢查；剝離腫瘤稱重計算抑瘤率。結(jié)果菲牛蛭提取物與順鉑聯(lián)合使用具有抑制腫瘤生長的作用(P<0.05)。與順鉑組比較，聯(lián)合用藥后菲牛蛭提取物可使S180荷瘤鼠的ALT、AST、TBIL、BUN、CREA含量降低(P<0.05)。結(jié)論菲牛蛭提取物與順鉑聯(lián)合使用治療S180荷瘤鼠具有相加作用，同時菲牛蛭提取物可減輕順鉑引起的肝腎毒性。

菲牛蛭；順鉑；S180；抗腫瘤

中藥水蛭資源具有可持續(xù)利用和發(fā)展的重要性[1]，而菲牛蛭(Poecilobdella manillensis)，別名馬尼擬醫(yī)蛭，俗稱金邊螞蟥，隸屬于環(huán)節(jié)動物門、蛭綱、無吻蛭目、醫(yī)蛭科、牛蛭屬[2、3]，作為目前常見吸血類水蛭中個體較大的品種，至今尚未被列入中國藥典。現(xiàn)研究表明，菲牛蛭具有抗凝血、抗血栓、降血脂等藥理作用[4-7]，提示其有較好的臨床應(yīng)用前景[8]。水蛭、復方水蛭素具有體內(nèi)外抗腫瘤作用[9、10]，菲牛蛭及其提取物在抗腫瘤方面的研究較少，其對抗腫瘤藥物減毒作用方面亦未見報道。作為治療多種實體瘤一線抗腫瘤藥的順鉑，對腫瘤殺傷作用效果顯著，但毒副作用明顯，尤其是肝腎毒性[11]。本實驗旨在研究菲牛蛭提取物聯(lián)合順鉑治療S180荷瘤鼠效果，以及其對順鉑減毒的作用。

1 材料

1.1 藥物 菲牛蛭提取物(批號：20120730；性狀：棕色干粉；含量：500ATU/g抗凝血酶活性單位，由南寧市科康生物技術(shù)有限公司提供)，為廣西菲牛蛭唾液提取物，用時用生理鹽水配制成0.3g/ml溶液。注射用順鉑(批號：2011026CF；性狀：黃色凍干粉末；齊魯制藥有限公司生產(chǎn))，用時用生理鹽水配制成0.5mg/ml溶液。

1.2 試劑及細胞株 總膽紅素(TBIL)試劑盒(釩酸鹽氧化法)(批號：20130816)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒(液體)(紫外乳酸脫氫酶法)(批號：20130826)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(紫外-蘋果酸脫氫酶法)(批號：20131026)、尿素(BUN)試劑盒(肌氨酸氧化酶法)(批號：20130526)、肌酐(CREA)試劑盒(肌氨酸氧化酶法)(批號：20130712)、PBS緩沖液(批號：13090905)由廣州威佳科技有限公司提供；甲醛溶液(批號：130120，廣州市中南化學試劑有限公司)；0.9%氯化鈉注射液(生理鹽水)(批號：20130512，四川科倫藥業(yè)股份有限公司)。肉瘤細胞S180，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心細胞庫提供。

1.3 CKX41儀器倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司；TDL-5-A低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；ACS電子天平，中山市衡新電子有限公司；0-150游標卡尺，上海臺海工量具有限公司；日立7020型全自動生化分析儀，日本株式會社日立高新技術(shù)有限公司。

1.4 動物 SPF級雌性BALB/c小鼠，50只，體重18～22g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，實驗動物質(zhì)量合格證明編號：44007200004558。飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學實驗動物中心SPF級動物房內(nèi)，實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2008-0002。飼養(yǎng)溫度與濕度：20～26℃，40%～70%，采用10h：14h晝夜間斷照明，喂以鼠專用全價顆粒飼料(由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供)，自由進食飲水。

2 方法

2.1 S180荷瘤鼠模型的建立 復蘇S-180小鼠腹水瘤細胞，臺盼蘭染色活細胞計數(shù)，用PBS配成濃度為1×107個/ml的細胞懸液，對2只小鼠腹腔注射0.25ml細胞懸液，注射前用75%的酒精消毒小鼠腹部，且每次注射前需混勻細胞懸液。5d后，無菌抽取小鼠腹水，以PBS配成濃度為5.0×106個/ml的細胞懸液。將檢疫合格的BALB/c小鼠先剪去左前肢背部的被毛，再用碘酒消毒，每只小鼠左前肢背部皮下接種0.2ml的5.0×106個/ml的S-180腹水溶液，每次注射前需混勻腹水溶液。

2.2 動物分組 造模10d后，將腫瘤生長均勻且腫瘤體積約100mm3的40只雌性BALB/c小鼠按腫瘤體積隨機分為陰性對照組、順鉑組、菲牛蛭提取物組、菲牛蛭提取物+順鉑組，每組10只。

2.3 給藥方式及取材 分組后各組小鼠開始給藥。陰性對照組按20ml/kg體重灌胃給予生理鹽水；順鉑組按5mg/kg體重腹腔注射給予順鉑注射液；菲牛蛭提取物組按6g/kg體重灌胃給予菲牛蛭提取物藥液；菲牛蛭提取物+順鉑組按6g/kg體重灌胃給予菲牛蛭提取物藥液，同時按5mg/kg體重腹腔注射給予順鉑注射液。每天1次、連續(xù)給藥7d。

每2～3天測量2次腫瘤長短徑；腫瘤體積按公式：V=1/2ab2測量計算，a、b分別表示長和寬；計算相對腫瘤增殖率T/C(%)：針對每一種人癌異體移植瘤模型的抗腫瘤活性評價指標。計算公式如下：T/C%=TRTV/CRTV×100%。(TRTV：治療組RTV；CRTV：陰性對照組RTV)。根據(jù)測量的結(jié)果計算出相對腫瘤體積(relative tumor volume，RTV)，計算公式為：RTV=Vt/V0。其中V0為分籠給藥時(即d0)測量所得腫瘤體積，Vt為每一次測量時的腫瘤體積。

末次給藥后24h，取血后頸椎脫臼處死各組小鼠，取腎臟置于10%中性甲醛溶液(pH7.2～7.4)中固定，進行H.E組織病理學檢查。剝離腫瘤稱重并計算抑瘤率。將小鼠血清置于-80℃保存，用于檢測血清中ALT、AST、TBIL、CREA、BUN含量。

腫瘤生長抑瘤率(%)=(陰性對照組平均瘤重﹣治療組平均瘤重)/陰性對照組平均瘤重×100%。

2.4 菲牛蛭提取物對順鉑治療S180荷瘤鼠的聯(lián)合效應(yīng) 根據(jù)金正均公式[12]計算菲牛蛭提取物與順鉑聯(lián)合用藥效應(yīng)：兩藥合用抑制率：q值=[E(a+b)]/[Ea+Eb-Ea×Eb]。Ea、Eb：表示兩藥單用時各自的抑瘤率，q<0.85說明兩藥合用有拮抗作用；q≥1.15說明兩藥有協(xié)同作用；0.85

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用方差分析、Student-Newman-Keuls方法進行統(tǒng)計分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 菲牛蛭提取物聯(lián)合順鉑對S180荷瘤鼠腫瘤體積的影響 表1顯示，與陰性對照比較，分組時各組小鼠腫瘤體積均勻。給藥第6、8d時，順鉑組及菲牛蛭提取物+順鉑組腫瘤體積明顯縮小(P<0.05)，菲牛蛭提取物組腫瘤體積有縮小趨勢。

表1 菲牛蛭提取物聯(lián)合順鉑對S180荷瘤鼠腫瘤體積的影響±s)

注：與陰性對照組比較，*P<0.05。

圖1顯示，各組相對腫瘤增殖率T/C(%)隨著給藥時間延長不斷下降，以順鉑組和菲牛蛭提取物+順鉑組下降更顯著。

3.2 菲牛蛭提取物聯(lián)合順鉑對S180荷瘤鼠的腫瘤質(zhì)量和抑瘤率的影響 表2顯示，與陰性對照組比較，順鉑組腫瘤質(zhì)量顯著下降(P<0.05)，菲牛蛭提取物組腫瘤質(zhì)量下降，菲牛蛭提取物+順鉑聯(lián)合用藥組腫瘤質(zhì)量顯著下降(P<0.05)。

3.3 菲牛蛭提取物對順鉑治療S180荷瘤鼠的聯(lián)合效應(yīng) 根據(jù)金氏公式，以及各給藥組的抑瘤率計算。菲牛蛭提取物+順鉑組的聯(lián)合效應(yīng)如下：q值=0.7792/(0.8662+0.2869-0.8662×0.2869)=0.8614>0.85，說明菲牛蛭提取物與順鉑具有相加作用。

表2 菲牛蛭提取物聯(lián)合順鉑對S180荷瘤鼠腫瘤質(zhì)量和抑瘤率的影響

注：表示與陰性對照組比較，*P<0.05。

3.4 對順鉑治療S180荷瘤鼠血清中肝腎功能指標的影響 表3顯示，與陰性對照組比較，順鉑組的ALT、AST、TBIL、CREA和BUN含量明顯升高(P<0.05)。與順鉑組比較，菲牛蛭提取物+順鉑組聯(lián)合用藥后可使S180荷瘤鼠ALT、AST、TBIL、CREA和BUN含量降低(P<0.05)。

3.5 菲牛蛭提取物對順鉑治療S180荷瘤鼠腎臟組織病理的影響 陰性對照組、菲牛蛭提取物組腎臟組織病理(HE染色)顯示其腎臟結(jié)構(gòu)正常，無病理變化。順鉑組10只小鼠均可見出現(xiàn)少量腎小管透明管型、蛋白管型；菲牛蛭提取物+順鉑組10只小鼠僅6例出現(xiàn)少量腎小管透明管型、蛋白管型，說明聯(lián)合用藥后菲牛蛭提取物可減少腎臟透明管型的出現(xiàn)或使其出現(xiàn)時間延長。

表3 菲牛蛭提取物對順鉑治療S180荷瘤鼠血清肝腎功能指標的影響±s)

注：與陰性對照組比較，*P<0.05；表示與順鉑組比較，#P<0.05。

4 討論

目前，惡性腫瘤已成為威脅人類生命健康的疾病之一。在對惡性腫瘤的治療中，順鉑是目前最成功的化療藥物之一，其治療腫瘤種類廣泛，具有很高的治愈率。但使其使用受限的因素有兩個：一是獲得性腫瘤耐藥性；二是順鉑嚴重的毒副作用，尤其是腎毒性[13]。因此在順鉑治療腫瘤的過程中，如何不影響甚至增強其療效的同時減輕其毒副作用是目前臨床面臨的問題。

現(xiàn)代藥理研究證實，水蛭具有抗腫瘤作用，對癌瘤生長有抑制、破壞作用，水蛭還有抗高凝作用，有利于抗癌藥及免疫活性細胞侵入癌組織而殺傷癌細胞。本研究顯示，菲牛蛭提取物單獨使用對S180荷瘤鼠的腫瘤生長具有抑制腫瘤生長的趨勢，與順鉑聯(lián)合用藥后，其抑瘤效果比單用菲牛蛭效果明顯。經(jīng)計算說明菲牛蛭提取物與順鉑具有相加的抗腫瘤作用。另外，給藥7d后，順鉑組的ALT、AST、TBIL、BUN、CREA肝腎功能指標顯著升高，菲牛蛭提取物聯(lián)合順鉑用藥，小鼠各項肝腎功能指標均明顯下降，提示順鉑對S180荷瘤鼠具有一定的肝腎毒性作用，而菲牛蛭提取物在一定程度上能夠拮抗順鉑對S180荷瘤鼠的肝腎毒副作用。而菲牛蛭提取物對順鉑治療S180荷瘤鼠減毒的具體機制還有待進一步的研究。在本研究過程中還發(fā)現(xiàn)，菲牛蛭提取物并不能完全緩解由順鉑引起的小鼠體重減輕情況；另外順鉑毒副作用較廣，本研究僅涉及其肝腎毒性方面，對其他毒性是否具有減輕作用仍有待進一步研究。本研究還進行了菲牛蛭提取物急性毒性研究，采用最大給藥量法18g/kg體重劑量灌胃給予小鼠，觀察14d未見出現(xiàn)毒性表現(xiàn)，體重正常增長。說明菲牛蛭提取物本身毒性較低，綜合其藥理作用，繼續(xù)開發(fā)利用菲牛蛭具有較高的應(yīng)用價值。由于菲牛蛭提取物為菲牛蛭唾液提取，屬于粗提物，唾液粗提物成分較廣，若能進一步分離純化提取出其抗腫瘤成分及其減毒成分，對進一步研究其抗腫瘤等作用具有重要意義。

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AttenuationeffectofmanillensisextractoncisplatininthetreatmentofmicebearingS180tumor

HUANG Hong-kun WANG Nuo WANG Yi HUANG Xiao-hong LIU Sheng-lai XUN Xia LIN Xiao-ting REN Hai-tao KUANG Shao-xiong*

Guangdong Medical Laboratory Animal Center, Foshan 528248,China

ObjectiveManillensis extract combined with cisplatin in the treatment of mice bearing S180 tumor and attenuation effects.MethodS180 tumor-bearing mice model for 10 days,fourty BALB/c mice were randomly divided into negative tumor volume in the control group,cisplatin, manillensis extract group, manillensis extract+cisplatin group.After the group began to administration, continuous.administration for 7 days, 10 mice in each group were sacrificed on eighth day, the serum to detect indicators of liver and kidney function; taken for histopathological examination of kidney; peel the tumor weighed to calculate the inhibition rate.ResultsManillensis extract in combination with cisplatin inhibited tumor growth (P<0.05).compared with cisplatin,the combination therapy can extract manillensis ALT S180 tumor-bearing mice, AST, TBIL, BUN, CREA was decreased (P<0.05).ConclusionManillensis extract used in combination therapy with cisplatin S180 tumor-bearing mice have an additive effect, while manillensis extract kidney toxicant reduce cisplatin-induced.

manillensis; cisplatin; S180; anti-tumor effect

廣東省中醫(yī)藥管理局項目(20121279)。

黃紅坤(1978-)，女，漢族，廣西靈山人，助理研究員，碩士學位，主要從事藥理學與毒理學研究工作。

鄺少松(1973-)，女，漢族，廣東佛山人，高級獸醫(yī)師，碩士學位，主要從事藥理學與毒理學研究、實驗室管理工作。

R285.5

A

1007-8517(2014)13-0012-03

2014.04.25)