趙靜 劉繼勇 張海 曹永兵 鄭慶虎 吳建華

(1.上海長海醫(yī)院皮膚科，上海 200433;2.第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院藥材科，上海 200433;3.第二軍醫(yī)大學肝膽醫(yī)院藥材科，上海 200433;4.第二軍醫(yī)大學藥學院藥理學教研室，上海 200433;5.解放軍153中心醫(yī)院皮膚科，鄭州 450042)

白念珠菌是人體常見的條件致病真菌，可在黏膜上寄生或增殖，引起口腔炎、食道炎、陰道炎等疾病。在免疫力低下的人群中還可侵襲各種黏膜屏障，進入血液循環(huán)，引起嚴重的播散性念珠菌病，常常危及生命［1］，因而，與其致病相關的蛋白和基因，如與黏附相關的KRE、ALA、ALS家族等，已成為國內(nèi)外研究的熱點。早在1999年，中科院上海生化研究所陳江野教授及其團隊，利用寡聚核苷酸篩選白念珠菌MAPK相關蛋白激酶基因，得到了CRK 1(CDC2-related protein kinase 1)基因，同時利用同源重組原理，敲除了CRK 1雙拷貝基因片段，構建CRK 1純合缺失株，發(fā)現(xiàn)CRK 1基因的缺失影響到白念珠菌的生長速度、絮狀生長和形態(tài)發(fā)生［2］。近年來，許多研究表明:白念珠菌的毒力因素包括黏附、侵襲、利于侵入的酶、表型轉(zhuǎn)換及生物被膜的形成等［3］。本文擬在前人研究的基礎上，進一步證實CRK 1基因?qū)Π啄钪榫螒B(tài)發(fā)生的影響，同時研究CRK 1基因?qū)Π啄钪榫じ郊吧锉荒ば纬傻挠绊?，進一步探討CRK 1基因在白念珠菌發(fā)病機制中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株及細胞 本研究所采用的白念珠菌標準株SC5314由第二軍醫(yī)大學藥理教研室提供，基因敲除菌Δcrk 1［2］由中科院上海生化研究所陳江野教授饋贈。實驗用Caco-2細胞購于中國科學院上海細胞庫。

主要試劑 MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS(Hyclone公司)，胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、MTT、DMSO(Sigama公司)，RPMI-1640液體培養(yǎng)基 (Gibico公司)，SDA培養(yǎng)基及YEPD液體培養(yǎng)基根據(jù)文獻配制和保存。

1.2 方法

白念珠菌菌懸液的制備 將凍存的菌株解凍接種于沙氏培養(yǎng)基復蘇、分離純化，挑取單菌落將其轉(zhuǎn)種于YPED液體培養(yǎng)基中，30℃搖床，200 r/min，培養(yǎng)過夜，取活化后的菌液10 μL，加入YEPD培養(yǎng)基1 mL，30℃搖床培養(yǎng)16 h，收集菌體、PBS緩沖液清洗3次后，根據(jù)實驗要求稀釋，采用血球計數(shù)板計數(shù)法將菌液稀釋成不同濃度。

將處于對數(shù)生長期的上述兩種菌 (Δcrk 1及SC5314)分別用10%FBS及RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成106CFU/mL，分別取200 μL加入玻璃管內(nèi)，37℃，200 r/min 搖床，2 h 后取出，取10 μL 加入載玻片，再加蓋玻片，光學顯微鏡200倍鏡觀察，計算每個視野菌絲相和酵母相的數(shù)目，每張玻片取5個視野，重復3次，按菌絲形成率=菌絲數(shù)/(酵母數(shù)+菌絲數(shù))×100%，實驗方法參考Jayant等［4］。

CRK 1基因缺失對白念珠菌黏附的影響 腸黏膜模型的建立 將處于對數(shù)生長期的Caco-2細胞按1×105cells/mL接種于96孔板上，每孔100 μL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) (第1周隔天換液1次，之后每天換液)，顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，到第21天形成類似于腸黏膜上皮的緊密連接［5］。

不同時間Δcrk 1菌及標準菌SC5314對體外培養(yǎng)的腸黏膜黏附力的差異 將上述兩種菌用MEM培養(yǎng)基 (不含雙抗)稀釋成105CFU/mL備用，然后將培養(yǎng)好的單層腸黏膜上的培養(yǎng)基吸去，用PBS洗3遍，加入100 μL上述兩種菌懸液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 30 min、60 min、90 min、120 min，用PBS液洗5次，去除未黏附的菌，加入1%TritonX-100 50 μL于各孔，置室溫下10 min，當細胞被裂解后，加入50 μL PBS緩沖液終止裂解，混勻各孔懸液，在 60 min、90 min、120 min 各時間點，用PBS稀釋4倍后、各取50 μL均勻的涂于SDA培養(yǎng)板上，于37℃培養(yǎng)24 h后，計算菌落數(shù)即為黏附數(shù)，黏附率=CFU(用Triton處理后的菌落數(shù))/CFU(最初每孔菌落計數(shù))×100%。每個時間點重復5次。

CRK 1基因的缺失對白念珠菌生物膜形成的影響 生物膜的制備［4］取100 μL菌懸液 (1.0×106個細胞)接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)2 h(黏附階段)后棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基，作為培養(yǎng)的0點，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h更換1次培養(yǎng)基，共培養(yǎng)48 h。同時在倒置顯微鏡下觀察生物膜的形態(tài)。

MTT法檢測CRK 1基因的缺失對白念珠菌生物膜形成的影響 生物膜在37℃培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，每孔加入100 μL 1 mg/mLMTT，37℃避光孵育4 h后棄去上清，每孔加入150 μL DMSO，15 min后用酶標儀測定其在490 nm波長處的OD值。每組設6個重復孔，重復3次。

結(jié)晶紫檢測CRK 1基因的缺失對白念珠菌生物膜形成的影響 如前所述:生物膜在37℃培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，加入10 μL 99%甲醇作用15 min后，將上清吸棄，晾干，加入100 μL 0.02%結(jié)晶紫作用15 min，蒸餾水洗3次，加入150 μL 33%醋酸溶液，用酶標儀于620 nm處讀數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗結(jié)果用±s表示，用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件包進行分析，兩組間比較用成組t檢驗，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 CRK 1基因的缺失對白念珠菌形態(tài)發(fā)生的影響(見圖1)

與SC5314相比，Δcrk 1菌分別在10%胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)條件下形成菌絲能力均較弱，兩者之間有統(tǒng)計學差異 (P＜0.05，見表1)。

2.2 CRK 1基因的缺失對白念珠菌黏附的影響(見圖2)

Δcrk 1菌及標準菌SC5314對腸黏膜的黏附數(shù)并不是隨時間的延長而增多，兩種菌均是在60 min黏附數(shù)達最高，達到飽和，60 min以后逐漸降低并保持平穩(wěn)。且在60 min、90 min、120 min時，標準菌SC5314比Δcrk 1菌的黏附數(shù)明顯增多，具有統(tǒng)計學差異 (P＜0.01，見表2)。

金鉆明就讀的高中——洋涇高級中學也非常注重對學生綜合素質(zhì)和學習興趣的培養(yǎng)。當時，浦東新區(qū)物理教研室組織安排了跨校的物理輔導班，這個輔導班選用新區(qū)的物理“尖子老師”來給學生授課，并且不以考試、競賽為目的，只是為了培養(yǎng)學生的興趣、開拓視野。因此很多學生都喜歡這個輔導班，金鉆明也是受惠者之一。至今讓金鉆明難忘的是他參加過的一個激光興趣班，在那里，他參與了激光全息照相，粗略地知道了信息如何能立體地存儲下來。在初步感受到激光魅力的同時也埋下了科學的種子，他最終如愿收到了上海大學電子信息科學與技術專業(yè)的錄取通知書。

2.3 Δcrk 1菌與其標準菌SC5314形成生物膜的

形態(tài)學觀察(見圖3)

在倒置顯微鏡下觀察白念珠菌生物膜形成的情況，標準菌SC5314可見酵母細胞菌和假菌絲在細胞外基質(zhì)中形成密集的生物膜;CRK 1基因缺失菌生物膜稀疏，主要由芽生孢子組成，見少量芽管樣結(jié)構，但未形成典型菌絲及假菌絲。

2.4 MTT法及結(jié)晶紫法檢測CRK 1基因的缺失對白念珠菌生物膜形成的影響

通過MTT法及結(jié)晶紫法兩種方法證實了，在經(jīng)48 h培養(yǎng)后，CRK 1基因缺失菌與其標準菌SC5314相比，形成生物膜的能力差，兩者比較有統(tǒng)計學差異 (P＜0.05，見表3)。

圖1 兩種菌在不同培養(yǎng)條件下的鏡下觀 (×200):a，b所示CRK 1基因缺失菌;a.10%胎牛血清37℃、200 r/min、2 h，b.RPMI-1640培養(yǎng)基37℃、200 r/min、2 h;Δcrk 1菌在兩種培養(yǎng)條件下，主要以酵母態(tài)存在，可見少量的出芽和延伸的菌絲;c，d所示標準菌SC5314;c.10%胎牛血清37℃、200 r/min、2 h，d.RPMI-1640培養(yǎng)基37℃、200 r/min、2 h;標準菌SC5314在兩種培養(yǎng)條件下，形成的出芽和菌絲的量多于a，b 圖2 黏附于腸黏膜上皮的菌落數(shù)(×200):與SC5314(b)相比，在同樣的培養(yǎng)時間和條件下，Δcrk 1(a)形成的菌落小且數(shù)量也少 圖3 培養(yǎng)48 h生物被膜的顯微鏡下觀(倒置顯微鏡×200):a.Δcrk 1菌，生物膜較為稀疏，可見較多出芽孢子及伸長的假菌絲，互相交錯，但未完全鋪滿基底;b.SC5314，可見大量的酵母細胞菌和伸長的假菌絲在細胞外基質(zhì)中形成密集的生物膜Fig.1 The Δcrk 1 and SC5314 in different conditions under the microscopic view Fig.2 The Δcrk 1(a)and SC5314(b)adhesion colony count in the intestinal mucosa epithelial Fig.3 Biofilm were observed microscopically(inverted microscope×200)

4 討 論

白念珠菌(Candida albicans)是一種多態(tài)性真菌，能以橢圓形的酵母態(tài)、細胞延長形成的假菌絲存在［6］。這些形態(tài)在它的生命中均發(fā)揮重要的功能。從酵母態(tài)向菌絲態(tài)轉(zhuǎn)化是白念珠菌的重要特征。對于不同形態(tài)在致病中的作用，目前存在爭議。但是，大多數(shù)學者認為:菌絲態(tài)的侵襲力更強［7］。研究發(fā)現(xiàn)，多種因素介導了白念珠菌的形態(tài)發(fā)生，如:血清或葡萄糖、CO2、溫度等［8］，另外，已有證據(jù)表明，有些基因的表達調(diào)控直接影響了白念珠菌的形態(tài)發(fā)生和毒力表現(xiàn)，如:ALS 3、HWP 1、ECE 1和HYR 1等［9］。

大量的研究表明［10］:MAPK(促分裂原活化蛋白激酶)信號通路及細胞周期依賴性激酶在白念珠菌菌絲的形成中發(fā)揮了關鍵作用。早在1996年，中科院上海生化研究所陳江野教授及其團隊，在篩選白念株菌MAPK相關蛋白激酶基因的過程中，得到CRK 1(CDC2-related protein kinase 1)基因。研究發(fā)現(xiàn):Crk1蛋白與釀酒酵母的Sgv1蛋白及人類Pk11/Cdk9蛋白相似，在多種培養(yǎng)條件下，如:YPD培養(yǎng)基、Lee培養(yǎng)基等，CRK 1基因敲除菌形成菌絲的能力較野生菌弱［3］。同樣，在我們的研究中也發(fā)現(xiàn):在 RPMI-1640培養(yǎng)基、PH7.0、37℃培養(yǎng)條件下，CRK 1基因敲除抑制了菌絲的生成。另外，我們都知道，血清能促進酵母菌向菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)化，而在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)，在含10%血清的培養(yǎng)基、PH7.0、37℃培養(yǎng)條件下，CRK 1基因敲除菌較野生菌形成菌絲的能力弱。我們的實驗結(jié)果與陳江野教授［3］的結(jié)果一致，即:CRK 1基因敲除菌在多種培養(yǎng)條件下總是抑制白念菌絲的形成，更充分地說明了:CRK 1基因參與了白念菌絲形成的調(diào)節(jié)。這可能是由于CDC2家族的蛋白激酶在真核生物周期的調(diào)控中起著關鍵作用，CRK 1基因作為CDC2相關的蛋白激酶，可能也參與細胞周期的調(diào)控。

表1 Δcrk 1及SC5314在不同培養(yǎng)條件下形成菌絲的差異(±s，n=15)Tab.1 C.albicans Δcrk 1 and SC5314 have different abilities to form hyphae at different conditions

表1 Δcrk 1及SC5314在不同培養(yǎng)條件下形成菌絲的差異(±s，n=15)Tab.1 C.albicans Δcrk 1 and SC5314 have different abilities to form hyphae at different conditions

注:*.與標準菌SC5314比較，P ＜0.05

組別菌絲形成率(%)10%胎牛血清RPMI-1640 SC5314 48.7 ±4.7 49.7 ±4.5 Δcrk 1 27.5 ±2.8 29.2 ±5.9 P 值 0.034* 0.031*

表2 Δcrk 1及SC5314在不同時間點對腸黏膜的黏附差異(CFU)(±s，n=5)Tab.2 C.albicans Δcrk 1 and SC5314 have different adhensions with human intestinal epithelial cells in vitro at differen time

表2 Δcrk 1及SC5314在不同時間點對腸黏膜的黏附差異(CFU)(±s，n=5)Tab.2 C.albicans Δcrk 1 and SC5314 have different adhensions with human intestinal epithelial cells in vitro at differen time

注:*.與標準菌SC5314比較，P ＜0.001

黏附菌落數(shù)(CFU)組別30 min 60 min 90 min 120 min SC5314 26.6 ±7.1 557.8 ±19.8 299 ±12.5 296 ±12.7 Δcrk 1 22.5 ±2.4 212.8 ±10.7 147.5 ±6.2 140 ±26.6 P 值 0.208 ＜0.001* ＜0.001* ＜0.001*

表3 MTT法及結(jié)晶紫法比較Δcrk 1菌及標準菌SC5314對白念珠菌生物膜形成的差異(±s，n=18)Tab.3 C.albicans Δcrk 1 and SC5314 have different abilities to form biofilm tested by MTT and crystal violet assay

表3 MTT法及結(jié)晶紫法比較Δcrk 1菌及標準菌SC5314對白念珠菌生物膜形成的差異(±s，n=18)Tab.3 C.albicans Δcrk 1 and SC5314 have different abilities to form biofilm tested by MTT and crystal violet assay

注:*.與標準菌SC5314比較，P ＜0.05

試驗分組不同波長的OD值OD490(MTT法) OD620(結(jié)晶紫法)SC5314 1.422 ±0.466 0.75 ±0.085 Δcrk 1 1.188 ±0.248 0.302 ±0.034 P 值 0.041* 0.012*

白念珠菌的毒力因素包括黏附、侵襲、利于侵入的酶、表型轉(zhuǎn)換及生物被膜的形成等［11］，黏附是其致病的前提，也是形成集落并入侵人體的第一步，因而，我們進一步觀察了CRK 1基因?qū)Π啄钪榫じ降挠绊憽Ｎ覀兝肅aco-2細胞體外模擬腸黏膜上皮，具有相對簡單、重復性好的優(yōu)點，且大量的實驗已證實這個模型與人腸黏膜結(jié)構相似［12］。實驗結(jié)果表明:Δcrk 1菌及標準菌SC5314對腸黏膜的黏附數(shù)并不是隨時間的延長而增多，兩種菌均是在60 min黏附數(shù)最高，達到飽和，60 min以后逐漸降低并保持平穩(wěn)。且在60 min、90 min、120 min時，標準菌 SC5314 比 Δcrk 1菌的黏附數(shù)明顯增多，具有統(tǒng)計學差異。研究發(fā)現(xiàn)，黏附的程度常依賴于微生物、宿主或無生命物質(zhì)表面的特征，如:微生物細胞表面的疏水結(jié)構和細胞壁的組成等，疏水性越強越有利于黏附，白念珠菌菌絲態(tài)表面有大量的疏水結(jié)構，所以更有利于黏附［11］。推測CRK 1基因可能參與了白念珠菌細胞表面疏水結(jié)構的調(diào)控。

生物被膜的形成是各種念珠菌潛在的毒力因子，它可通過限制抗真菌藥進入生物被膜，從而對藥物產(chǎn)生耐藥。同時，生物被膜可為病原微生物提供“保護所”，使其免受宿主巨噬細胞的吞噬作用［13］。目前已成為臨床亟待解決的關鍵問題。如上圖3所示:CRK 1基因缺失菌形成的生物膜較為稀疏，可見較多出芽孢子及伸長的菌絲，互相交錯，但未完全鋪滿基底。而標準菌SC5314可見大量酵母細胞菌和假菌絲在細胞外基質(zhì)中形成密集的生物膜。體外實驗發(fā)現(xiàn)，生物被膜形成的早期，酵母菌黏附于宿主表面并逐漸向菌絲態(tài)轉(zhuǎn)化，這是生物被膜形成的關鍵一步。Nobile等［14］發(fā)現(xiàn)，與正常白念珠菌相比，缺乏形成菌絲態(tài)的突變株黏附力降低，難于形成空間的三維結(jié)構。

以上我們的研究發(fā)現(xiàn)，CRK 1基因缺失影響了白念珠菌菌絲態(tài)的形成，同時對白念珠菌黏附及生物被膜的形成都有抑制作用。因此，我們可以推測，CRK 1基因在白念珠菌的致病力方面發(fā)揮重要的作用，但是，其具體的信號通路值得我們進一步的深入研究。

5 致 謝

感謝上海生化研究所陳江野教授惠贈CRK 1基因敲除菌。

［1］Richter SS，Galask RP，Messer SA，et al.Antifungal susceptibilities of Candida species causing vulvo vaginitis and epidemiology of recurrent cases［J］.Clin Microbiol，2005，43(5):2155-2162.

［2］王勤，周頌，陳江野.白色念珠菌CRK1基因的敲除及其功能研究［J］.生物化學與生物物理學報，1999，31(5):545-552.

［3］Francois L，Mayer，Duncan Wilson，et al.Candida albicanspathogenicity mechanisms［J］Virulence，2013，4(2):119-128.

［4］Jayant SR，Ravikumar BS，Nitin MC，et al.Terpenoids of plant origin inhibit morphogenesis，adhesion，and biofilm formation byCandida albicans［J］.Biofouling，2013，29(1):87-96.

［5］Stetinova V，Smetanova L，Kholova D，et al.Transepithelial transport of ambroxol hydrochloride across human intestinal Caco-2 cell monolayers［J］.Gen Physiol Biophys，2009，28(3):309-315.

［6］Berman J，Sudbery PE.Candida albicans:a molecular revolution built on lessons from budding yeast［J］.NatRev Genet，2002，3(12):918-930.

［7］Munro CA，Bates S，Buurman ET，et al.Mnt1p and Mnt2p ofCandida albicansare partially redundant alpha-1，2-mannosyltransferases that participate in O-linked mannosylation and are required for adhesion and virulence.［J］.J Biol Chem，2005，280(2):1051-1060.

［8］Sudbery PE.Growth ofCandida albicanshyphae［J］.Nat Rev Microbiol，2011，9(10):737-748.

［9］Nobile CJ，Solis N，Myers CL，et al.Candida albicanstranscription factor Rim101 mediates pathogenic interactions through cell wall functions［J］.Cell Microbiol，2008，10(11):2180-2196.

［10］Chen J，Zhou S，Wang Q，et al.Crk1，a novel Cdc2-related protein kinase，is required for hyphal development and virulence inCandida albicans［J］.Mol Cell Biol，2000，20(3):8696-8708.

［11］Camacho DP，Gasparetto A，Svidzinski TI.The effect of chlorhexidine and gentian violet on the adherence ofCandidaspp.to urinary catheters［J］.Mycopathologia，2007，163(5):261-266.

［12］Clayburgh DR，Shen L，Turner JR，et al.A porous defense:the leaky epithelial barrier in intestinal disease ［J］.Lab Invest，2004，84(3):282-291.

［13］Mukherjee PK，Chandra J.Candida biofilm resistance［J］.Drug Resist Updat，2004，7(4-5):301-309.

［14］Nobile CJ，Nett JE，Andes DR，et al.Function ofCandida albicansadhesin Hwp1 in biofilm formation［J］.Eukaryot Cell，2006，5(10):1604-1610.