康 帥，殷中瓊，賈仁勇，2，代如意，李 莉，彭練慈，曲 徑，梁 陳

(1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川雅安 625014;2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)研究所，四川雅安 625014)

烏梅等20種中藥對胸膜肺炎放線桿菌的體外抗菌活性研究

康 帥1，殷中瓊1，賈仁勇1，2，代如意1，李 莉1，彭練慈1，曲 徑1，梁 陳1

(1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川雅安 625014;2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)研究所，四川雅安 625014)

【目的】觀察烏梅Fructus mume等20種中藥的體外抗胸膜肺炎放線桿菌Actinobacillus pleuropneumoniae活性.【方法】通過乙醇回流、水煎煮和超聲波等方法對20種中藥進(jìn)行提取，采用二倍稀釋法測定其對胸膜肺炎放線桿菌的體外抗菌活性;并研究抗菌活性較強(qiáng)的幾味中藥的體外聯(lián)合抑菌活性.【結(jié)果和結(jié)論】烏梅、黃連Rhizoma coptidis、訶子Terminalia chebula、秦皮Cortex fraxini、地榆Sanguisorbae officinalis、虎杖Polygonum cuspidatum 6種中藥提取物對胸膜肺炎放線桿菌的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)范圍是6.25～50.00 mg/mL;大青葉Isatis indigotica、茵陳Artemisia capillaris、甘草Glycyrrhiza uralensis和白鮮皮Dictamnus dasycarpus 4種中藥提取物的MIC范圍是50.00～100.00 mg/mL;黃柏Phellodendron amurense、杜仲Eucommia ulmoides、金銀花Lonicera japonica、柴胡Bupleurum chinense、蒲公英Taraxacum mongolicum、板藍(lán)根Baphicacanthus cusia、梔子Gardenia jasminoides和黃芪Astragalus membranaceus等10種中藥提取物的MIC＞100.00 mg/mL.聯(lián)合抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，烏梅、黃連、訶子和虎杖兩兩聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI)≤1，烏梅、虎杖分別與秦皮的FICI＞2.烏梅、黃連、訶子、虎杖、秦皮、地榆對胸膜肺炎放線桿菌均具有較好的體外抗菌活性;烏梅、黃連、訶子和虎杖兩兩聯(lián)合為相加、協(xié)同作用;秦皮分別與烏梅、虎杖為拮抗作用.

烏梅;黃連;訶子;虎杖;胸膜肺炎放線桿菌;抗菌活性

胸膜肺炎放線桿菌Actinobacillus pleuropneumoniae屬巴氏桿菌科嗜血桿菌屬，后根據(jù)其表型和DNA雜交水平均與放線桿菌屬模式種密切相關(guān)，歸屬為巴氏桿菌科放線桿菌屬.常與巴氏桿菌等混合感染［1］，是引起豬上呼吸道感染的主要病原菌之一.主要引起豬傳染性胸膜肺炎，表現(xiàn)為急慢性炎癥，急性死亡率較高，常伴隨豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染，是一種高度傳染性疾?。?-3］.目前豬傳染性胸膜肺炎的治療主要采用抗菌藥物，如氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星等，大量抗菌藥物的使用，增加了胸膜肺炎放線桿菌的耐藥性，同時(shí)由于抗菌藥物的濫用，造成藥物殘留和環(huán)境污染等諸多社會問題.針對抗菌藥物所帶來的諸多問題，獸醫(yī)臨床急需尋找低毒有效的抗菌藥物替代品，以控制疾病的發(fā)生.據(jù)研究報(bào)道，中藥或天然植物提取物，可發(fā)揮對病原菌的直接殺滅作用不產(chǎn)生耐藥性［4-5］.因此如何從中藥中尋找抗胸膜肺炎放線桿菌新藥已經(jīng)成為藥物開發(fā)的熱點(diǎn).本研究選擇烏梅、黃連等20種具有抗菌活性的中藥，提取其不同部位，研究其對胸膜肺炎放線桿菌的體外抗菌活性，以期為篩選得到對胸膜肺炎放線桿菌具有抗菌作用的中藥及其復(fù)方奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

烏梅Fructus mume(產(chǎn)地四川，批次：120315)、黃連Rhizoma coptidis(產(chǎn)地四川，批次：080406)、訶子Terminalia chebula(產(chǎn)地云南，批次：081121)、虎杖Polygonum cuspidatum(產(chǎn)地四川，批次：081102)、柴胡Bupleurum chinense(產(chǎn)地甘肅，批次：080301)、板藍(lán)根Baphicacanthus cusia(產(chǎn)地甘肅，批次：080921)、黃柏Phellodendron amurense(產(chǎn)地四川，批次：080923)、大青葉Isatis indigotica(產(chǎn)地四川，批次：100310)、杜仲Eucommia ulmoides(產(chǎn)地云南，批次：080916)、蒲公英Taraxacum mongolicum(產(chǎn)地貴州，批次：100217)、白鮮皮Dictamnus dasycarpus(產(chǎn)地遼寧，批次：080914)、茵陳Artemisia capillaris(產(chǎn)地河北，批次：080923)、秦皮Cortex fraxini(產(chǎn)地山西，批次：100330)、梔子Gardenia jasminoides(產(chǎn)地廣西，批次：080622)、黃芪Astragalus membranaceus(產(chǎn)地陜西，批次：040824)、魚腥草Houttuynia cordata(產(chǎn)地四川，批次：100310)、甘草Glycyrrhiza uralensis(產(chǎn)地甘肅，批次：081102)、夏枯草Prunella vulgaris(產(chǎn)地河南，批次：101114)、地榆Sanguisorbae officinalis(產(chǎn)地陜西，批次：040827)、金銀花Lonicera japonica(產(chǎn)地四川，批次：080919)20種中藥均購于四川雅安惠民堂藥業(yè)連鎖有限責(zé)任公司，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)藥學(xué)系副教授范巧佳鑒定為正品.

胸膜肺炎放線桿菌(ATCC265)，購買于中國獸藥監(jiān)察所.含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%煙酰胺腺嘌呤二核甘酸(NAD)的 TSB液體培養(yǎng)基、含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%NAD的TSA固體培養(yǎng)基.96微孔細(xì)胞培養(yǎng)板、SPX型生化培養(yǎng)箱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、索氏提取器等.

1.2 方法

1.2.1 20種中藥有效部位的提取 烏梅、黃連、訶子、虎杖等20種中藥按文獻(xiàn)［6-19］的方法進(jìn)行有效部位的提取，壓縮烘干成浸膏.

1.2.2 藥液制備 將20種中藥提取物浸膏溶于二甲基亞砜中，配制成質(zhì)量濃度為1 g/mL的儲備液，高壓蒸汽滅菌，4℃冰箱保存.

1.2.3 有效部位抗菌活性研究 參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)推薦的對細(xì)菌敏感性檢測方案，采用試管二倍稀釋法，測定20種中藥有效部位提取物對胸膜肺炎放線桿菌的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC);用TSA瓊脂平板涂板法測定20種中藥有效部位提取物對胸膜肺炎放線桿菌的最小殺菌濃度(Minimal bactericidal concentration，MBC).

菌液制備：采用平板菌落計(jì)數(shù)法確定菌液濃度.將胸膜肺炎放線桿菌菌液進(jìn)行10倍系列稀釋，分別取不同稀釋度的菌液0.1 mL滴加于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%NDA的TSA平板上，用無菌涂布器涂布均勻，每稀釋度重復(fù)2塊平板，37℃溫箱中培養(yǎng)18～24 h.選取菌落數(shù)在30～300個(gè)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組稀釋度相同的平板取平均值作為菌落數(shù).計(jì)算出原菌液細(xì)菌濃度，作為細(xì)菌菌液的標(biāo)準(zhǔn)濃度.

藥敏試驗(yàn)方法：采用試管二倍稀釋法.取無菌試管16支，分為試驗(yàn)組和對照組，每組8支.分組編號后向試驗(yàn)組8支試管中各加l mL TSB肉湯，以無菌操作吸取已稀釋好的藥物1 mL加入第1管，混勻后依次倍比稀釋至第7管，混勻后自第7管棄去l mL，此時(shí)試管內(nèi)藥液濃度比依次為1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128，相當(dāng)于藥液質(zhì)量濃度為500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.60、7.80 mg/mL，第8管不加藥物為對照組管.對照組操作同試驗(yàn)組.用微量加樣器取已校正濃度的菌液0.1 mL，依次由低濃度向高濃度加到試驗(yàn)組各管中，混勻后，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h后分別觀察細(xì)菌的生長狀況，以渾濁度為指標(biāo)，以對照組為參考對象檢查試管中有無細(xì)菌生長，以藥物最低濃度管中無細(xì)菌生長者為該試驗(yàn)菌MIC.將MIC測定中判定未生長細(xì)菌的試驗(yàn)組中藥肉湯1 mL涂布于TSA瓊脂平板上，37℃條件培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果，以細(xì)菌菌落個(gè)數(shù)不超5個(gè)的管內(nèi)的藥物濃度，為該藥的MBC［20］.

1.2.4 聯(lián)合抑菌活性的研究 根據(jù)前期20味中藥有效部位體外MIC的測定，選取其中抗菌活性較強(qiáng)的幾味中藥進(jìn)行兩兩聯(lián)合抑菌活性的研究.

溶液配制：精確稱取抗菌活性較強(qiáng)的幾種中藥提取物0.20 g，溶于1 mL無菌蒸餾水中，超聲儀上超聲使其充分溶解，配制成質(zhì)量濃度為 200.00 mg/mL的藥物母液，滅菌，4℃冰箱保存.

聯(lián)合用藥選擇藥物的起始濃度約為2 MIC，用TSB培養(yǎng)液對上述藥液進(jìn)行倍比稀釋，使配方中提取物的初始濃度為2 MIC，終末濃度為1/64 MIC.

藥敏試驗(yàn)：將無菌96孔板在超凈臺用紫外燈照射30 min，以棋盤稀釋法8孔稀釋.單用藥物于藥敏板第1孔分別向右向下倍比稀釋，各8孔，每孔100 μL，第1排第9孔為空白對照，第1排第10孔為生長對照.聯(lián)合用藥藥敏板則分別在每孔依次加2種藥物各50 μL，向右向下2倍稀釋.藥物灌板后，按藥敏板的布局，每孔加入100 μL菌懸液.將藥敏板置于微量振蕩器上振蕩，使其充分混勻，37℃條件下培養(yǎng)18～36 h，置于有水環(huán)境中保持液量.

各味中藥藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)：參考劉忠義等［21］介紹的判斷標(biāo)準(zhǔn)，MIC＜7.80 mg/mL，為高度敏感; 7.80 mg/mL＜MIC＜250.00 mg/mL，為中度敏感; MIC＞250.00 mg/mL，為不敏感.

聯(lián)合用藥效果評價(jià)：試驗(yàn)結(jié)果以聯(lián)合抑菌指數(shù)(Fractiona inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)來判斷聯(lián)合效應(yīng)，表示為FICI=MIC(A)聯(lián)合/MIC(A)單獨(dú)+MIC(B)聯(lián)合/MIC(B)單獨(dú)，其中，A，B分別表示2種中藥種類.

當(dāng)FICI≤0.50時(shí)為協(xié)同作用;0.50＜FICI≤1.00時(shí)為相加作用;1.00＜FICI≤2.00時(shí)為無關(guān)作用;FICI＞2.00時(shí)為拮抗作用.

2 結(jié)果

2.1 20種中藥提取物的抗菌活性

由表1可知，20種中藥有效部位提取物中體外抑菌活性最強(qiáng)的為黃連、訶子和烏梅3種中藥，MIC均為15.60 mg/mL，其次為秦皮、地榆和虎杖3種中藥，MIC為31.25 mg/mL，抗菌活性稍差的是白鮮皮、茵陳、大青葉和甘草4種中藥，MIC為62.50 mg/mL，抗菌活性最差的為柴胡和夏枯草，MIC為125.00 mg/mL.由此可見，黃連、烏梅等12味中藥對胸膜肺炎放線桿菌表現(xiàn)為中度敏感.黃柏、金銀花、板藍(lán)根等8種中藥，MIC均為250.00 mg/mL，無抑菌活性，為不敏感.另外，黃連MBC為15.60 mg/mL，烏梅和虎杖MBC為31.25 mg/mL，訶子、秦皮、地榆和大青葉MBC為62.50 mg/mL，具有較強(qiáng)的殺菌活性，黃柏、蒲公英等13味中藥MBC≥125.00 mg/mL，表現(xiàn)出較弱殺菌活性.因而筆者選取抗菌活性較強(qiáng)且報(bào)道較少的烏梅、黃連、訶子、秦皮和虎杖5味中藥提取物進(jìn)行后續(xù)的聯(lián)合抑菌活性的研究.

2.2 5種中藥提取物的聯(lián)合抑菌活性

5種中藥提取物兩兩聯(lián)合的抑菌活性結(jié)果見表2，根據(jù)聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI)評價(jià)兩者的聯(lián)合效應(yīng).從表2可以看出，烏梅和秦皮、秦皮和虎杖FICI＞2.00，為拮抗作用;烏梅和黃連、黃連和訶子、黃連和秦皮、訶子和虎杖及黃連和虎杖FICI≤0.50，為協(xié)同作用;烏梅和訶子、烏梅和虎杖、訶子和秦皮0.50＜FICI≤1.00，為相加作用.

表1 20種中藥提取物體對胸膜肺炎放線桿菌體外抗菌活性Tab.1 Antimicrobial activity of active ingredient extract of twenty traditional Chinese medicines against Actinobacillus pleuropneumoniae

表2 5味中藥提取物兩兩聯(lián)合抑菌活性結(jié)果1)Tab.2 Joint antimicrobial activity of active ingredient extract of five traditional Chinese medicines against Actinobacillus pleuropneumoniae mg·mL-1

3 討論

試驗(yàn)采用二倍稀釋法進(jìn)行胸膜肺炎放線桿菌的體外抑菌試驗(yàn).由于中藥成分復(fù)雜，不同提取方法對抑菌活性有很大影響，本試驗(yàn)主要根據(jù)文獻(xiàn)［6-19］中最佳提取工藝對中藥有效部位進(jìn)行提取，然后測定中藥的MIC值.

據(jù)LIU等［22］報(bào)道，氟苯尼考、頭孢噻呋等化學(xué)藥物對胸膜肺炎放線桿菌療效顯著，普遍用于胸膜肺炎放線桿菌的治療，而Yoshimura等［23］檢測了16種抗菌化學(xué)藥物對不同血清型胸膜肺炎放線桿菌體外抑菌活性，發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮類和頭孢噻呋對胸膜肺炎放線桿菌抗菌活性較好，青霉素、黏菌素等抗生素對胸膜肺炎放線桿菌效果較弱，而且不同血清型胸膜肺炎放線桿菌都對它們產(chǎn)生了不同程度耐藥性.

本研究檢測到的黃連、訶子和烏梅 MIC均為15.60 mg/mL，秦皮、地榆和虎杖 MIC均為31.25 mg/mL，同時(shí)，黃連、烏梅、虎杖、訶子、秦皮和地榆MBC≤62.50 mg/mL，說明了黃連、訶子和烏梅等6種中藥中有效部位有較強(qiáng)的抑殺菌作用.據(jù)葛冰等［24］報(bào)道，將黃芪、桑白皮、陳皮和連翹4種中藥進(jìn)行組方后試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這些組合無毒副作用，無污染，無藥物殘留，超微粉碎后生物利用度高，療效顯著，臨床對豬胸膜肺炎放線桿菌有特效.劉仁志等［25］利用大蒜揮發(fā)油及其復(fù)方對胸膜肺炎放線桿菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，證明大蒜揮發(fā)油及其復(fù)方MIC為3.90 mg/mL，MBC為7.80 mg/mL有較強(qiáng)的抗菌活性.而宋波等［26］、蔡小華等［27］報(bào)道，黃連、烏梅、訶子、虎杖等對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎球菌等體外抑菌結(jié)果表明其MIC在7.80～250.00 mg/mL之間，為中度敏感，說明6種中藥活性部位能增強(qiáng)對細(xì)菌的抑菌作用.本試驗(yàn)研究表明黃連、烏梅和訶子等6種中藥對胸膜肺炎放線桿菌有較強(qiáng)抗菌作用，為后續(xù)藥物研究開發(fā)提供基礎(chǔ).

聯(lián)合抑菌試驗(yàn)顯示，黃連與烏梅、秦皮、訶子、虎杖聯(lián)合都產(chǎn)生協(xié)同作用，具有良好的抗菌作用.但由于黃連主要成分為鹽酸小檗堿，在配伍時(shí)能與大多數(shù)中藥形成沉淀，影響抗菌活性［28］，同時(shí)由于訶子含有大量鞣質(zhì)，在進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)時(shí)也會出現(xiàn)沉淀，影響試驗(yàn)結(jié)果觀察.因此，在進(jìn)行含有黃連和訶子的相關(guān)試驗(yàn)中應(yīng)優(yōu)化提取工藝，以減少沉淀的產(chǎn)生.而在聯(lián)合抑菌試驗(yàn)中，秦皮與烏梅、虎杖都呈拮抗作用，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證.

本研究表明，黃連、烏梅、訶子、虎杖、秦皮等中藥對胸膜肺炎放線桿菌具有較好的抗菌活性，黃連和烏梅、虎杖以及訶子呈協(xié)同或相加作用，研究結(jié)果為篩選治療胸膜肺炎放線桿菌病中藥新藥具有重要意義.

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【責(zé)任編輯 柴 焰】

A study on antibacterial activity of crude extract from twenty traditional Chinese medicines like Fructus mume against Actinobacillus pleuropneumoniae in vitro

KANG Shuai1，YIN Zhongqiong1，JIA Renyong1，2，DAI Ruyi1，LI Li1，PENG Lianci1，QU Jing1，LIANG Chen1
(1 College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China; 2 Preventive Veterinary Research Institute，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China)

【Objective】The antibacterial activity of twenty traditional Chinese medicines againstActinobacillus pleuropneumoniae in vitrowas evaluated in this study.【Method】Twenty traditional Chinese medicines likeFructus mumewere extracted by ethanol reflux extraction，water decoction and ultrasonic wave.Minimal inhibitory concentrations(MICs)of twenty traditional Chinese medicines againstA.pleuropneumoniaewere determined by the macrodilution broth method.The joint antimicrobial activity of some traditional Chinese medicines was evaluatedin vitro.【Result and conclusion】The results showed that the MICs of the extract obtained fromF.mume，Rhizoma coptidis，Terminalia chebula，Cortex fraxini，Sanguisorbae officinalisandPolygonum cuspidatumagainstA.pleuropneumoniaeranged from 6.25 to 50.00 mg/mL.MICs of the extract obtained fromIsatis indigotica，Artemisia capillaris，Glycyrrhiza uralensisandDictamnus dasycarpusranged from 50.00 to 100.00 mg/mL.MICs of the extract obtained fromPhellodendron amurense，Eucommia ulmoides，Lonicera japonica，Bupleurum chinense，Taraxacum mongolicum，Baphicacanthus cusia，Gardenia jasminoidesandAstragalus membranaceuswere higher than 100.00 mg/mL.The results of joint bacteriostatic test showed that the fractional inhibitory concentration index(FICI)of the pairwise combination ofF.mume，R.coptidis，Te.chebulaandPo.cuspidatumwas lower than or equal to 1，and FICI ofC.fraxiniwithPo.cuspidatumandF.mumewas higher than 2.TheF.mume，R.coptidis，Te.chebula，Po.cuspidatum，C.fraxiniandS.officinalishad a good antimicrobial activity.The pairwise combination ofF.mume，R.coptidis，Te.chebulaandPo.cuspidatumshowed an enhanced or additive synergy action，andC.fraxinishowed antagonistic action withF.mumeandPo.cuspidatum，respectively.

Fructus mume;Rhizoma coptidis;Terminalia chebula;Polygonum cuspidatum;Actinobacillus pleuropneumoniae;antimicrobial activity

S852.6

A

1001-411X(2014)03-0013-05

2013-08-19 優(yōu)先出版時(shí)間：2014-03-31

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/doi/10.7671/j.issn.1001-411X.2014.03.003.html

康 帥(1989—)，男，碩士研究生，E-mail:kangshuaij@163.com;通信作者:殷中瓊(1968—)，女，教授，博士，E-mail:yinzhongq@163.com

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD34B03):四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)(2013TD0015)

康 帥，殷中瓊，賈仁勇，等.烏梅等20種中藥對胸膜肺炎放線桿菌的體外抗菌活性研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35(3)：13-17.