王巖峰 秦光華 張玉強(qiáng) 楊明超 王 喆

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，遼寧 沈陽 110001)

脊髓原發(fā)性損傷后的繼發(fā)性損傷擴(kuò)大了損傷范圍，加重了損傷程度，是脊髓損傷后影響脊髓修復(fù)的重要病理過程。脊髓繼發(fā)性損傷的過程十分復(fù)雜，包括水腫、炎癥反應(yīng)、局部缺血、谷氨酸受體過度激活、脂質(zhì)過氧化作用、鈣離子超載等，但是目前尚無一個公認(rèn)的關(guān)于脊髓損傷后繼發(fā)傷的病理機(jī)制。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)對神經(jīng)元的生存、分化、生長起重要作用。腺病毒介導(dǎo)BDNF基因移植可促進(jìn)SCI 后紅核脊髓神經(jīng)元再生和修復(fù),能激活再生相關(guān)基因表達(dá)〔1〕。SCI后,BDNF在損傷局部升高,可以促進(jìn)脊髓神經(jīng)元和軸突的再生〔2〕。Ikeda 等〔3〕發(fā)現(xiàn),鞘內(nèi)注射BDNF可提高SCI急性期內(nèi)Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)和髓鞘堿性蛋白(MBP)在脊髓神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中的活性,從而對脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)起積極作用。Bcl-2屬于抑制細(xì)胞凋亡基因。潘磊等〔4〕研究發(fā)現(xiàn),Bcl-2 蛋白不僅在Wistar成年大鼠神經(jīng)元中提高表達(dá)；更多在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),同時降低Bax的表達(dá)；BBB評分表明,神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯減少,大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)明顯。國外有學(xué)者證實MP療法增強(qiáng)SCI 功能恢復(fù)的機(jī)制之一為提高Bcl-2 表達(dá)和抑制Bax 表達(dá)〔5〕。但是，外源性BDNF能否通過調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)參與急性脊髓損傷的發(fā)病機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報道。本研究旨在通過檢測各組大鼠Bcl-2的表達(dá)，為治療脊髓損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 羊抗大鼠Bcl-2、β-actin多克隆抗體(Santa- Cruz,CA);兔抗羊IgG、S-P免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒(福州邁新)。

1.2大鼠急性脊髓損傷動物模型的建立及分組 取健康成熟Wistar大鼠72只，雌雄不限，體重220～250 g,由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。隨機(jī)分為對照組，損傷組，BDNF組。模型制備：10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔內(nèi)注射麻醉，無菌原則下進(jìn)行背正中切口，切除T8、T9椎板，暴露硬脊膜。按Nystrom法將35 g重物通過2.2 mm×5 mm弧形光滑金屬墊片壓迫該段脊髓后正中部5 min，分層縫合，碘伏消毒。脊髓損傷后分6、12 h，1、3、7 d 共5個檢測時間點，每個時間點8只；BDNF組:損傷后，立即向硬脊膜下腔內(nèi)注射BDNF，分為6、12 h，1、3、7 d共5個檢測時間點，每個時間點8只；空白對照組8只，只做T9～T10椎板切除術(shù)。

1.3免疫組化 各組大鼠分別于脊髓損傷后各時間點取材，麻醉后剖胸，經(jīng)左心室-主動脈插管，4%多聚甲醛灌流固定。以傷處為中心取1.5 cm脊髓組織，多聚甲醛浸泡固定。常規(guī)蠟塊包埋，連續(xù)切片數(shù)張(縱切)，片厚6 μm，每只大鼠取12張切片，按SP試劑盒說明書測定Bcl-2的表達(dá):常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫處理、高溫修復(fù)、血清封閉、滴加一抗過夜(濃度均為1∶150),并同時用PBS代替一抗作為陰性對照，4 ℃孵育過夜、隔日滴加二抗孵育20 min、SABC 37℃孵育20 min，繼而二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,鏡下觀察顯色背景。以上各步驟間均用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min，而后蘇木素復(fù)染，蒸餾水沖洗，梯度酒精逐級脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡觀察脊髓組織變化。

1.4Western 印跡免疫蛋白印跡 動物以10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔內(nèi)注射，麻醉后，各時間點分別取4只動物，直視下取出距損傷中心區(qū)上下各0.5 cm兩段脊髓，置于裂解液中機(jī)械勻漿，4 ℃ 17 000 r/min離心1 h，吸出上清液，棄去沉淀。用考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合法，根據(jù)已知牛血清白蛋白溶液的濃度及其吸光度和樣品吸光度計算出樣品蛋白濃度和加樣量。加入樣品緩沖液，然后將樣品置于沸水浴中加熱5 min使蛋白質(zhì)變性。將制備好的樣品置于-20℃冰箱備用。制備12%分離膠，4%濃縮膠，用微量加樣器將樣品加在凝膠表面樣品槽中。電泳后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉TTBS緩沖液4℃過夜。一抗Bcl-2、β-actin(1∶200)室溫孵育2 h，洗膜，辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000,Santa Cruz)室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL試劑( Santa Cruz)反應(yīng)1 min，暗室曝光顯影后沖洗膠片。凝膠成像分析系統(tǒng)上攝像分析，測得目標(biāo)帶的IDV，進(jìn)而計算出各組樣品Bcl-2目標(biāo)帶的IDV與內(nèi)參照β-actin IDV的比值。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化結(jié)果 從免疫組化圖片上可以看出，對照組Bcl-2蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)較少(11.06±0.65)。損傷組在手術(shù)后6 h開始出現(xiàn)大量的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞凋亡,與對照組相比，Bcl-2蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05)，并在3 d時達(dá)到峰值;而在之后逐漸減少，但在7 d時仍有一定數(shù)量的Bcl-2陽性表達(dá)的細(xì)胞。而相比于實驗組的各時間點，BDNF組的大鼠脊髓Bcl-2陽性表達(dá)明顯低于損傷組。見圖1，表1。

2.2Western 印跡結(jié)果 與對照組相比(0.08±0.01)，脊髓損傷組大鼠損傷后6、12 h，1、3、7 d的Bcl-2表達(dá)明顯升高(P<0.05)，且逐漸上升，3 d達(dá)高峰，而在之后逐漸減少，但在7 d時仍有大量表達(dá)；BDNF組6、12 h，1、3、7 d時間點的大鼠脊髓Bcl-2陽性表達(dá)明顯低于損傷組(圖2，表1)。

圖1 免疫組化方法檢測各組小鼠Bcl-2蛋白的表達(dá)(×200)

表1 各組小鼠Bcl-2蛋白光密度值及NF-κB灰度值比較±s,n=4)

圖2 Western印跡方法檢測各組小鼠Bcl-2和 β-actin蛋白表達(dá)

3 討 論

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為,脊髓損傷后神經(jīng)元和軸突不可再生,其主要原因是損傷局部環(huán)境缺乏營養(yǎng)物質(zhì)和誘導(dǎo)軸突再生的蛋白因子〔6〕。但有研究發(fā)現(xiàn),SCI后脊髓神經(jīng)元和軸突仍具有一定的再生能力,但這種再生需要有神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTFs)的營養(yǎng)支持〔7〕。BDNF是NTFs家族中的成員之一,對神經(jīng)元的生存、分化、生長起重要作用〔8〕。SCI后,BDNF在損傷局部的升高,可以促進(jìn)脊髓神經(jīng)元和軸突的再生〔9〕,目前已成為SCI 研究中的熱點之一。

Bcl-2主要位于線粒體外膜、核被膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,可抑制細(xì)胞凋亡基因。有研究證實,米諾環(huán)素能提高SCI后神經(jīng)功能恢復(fù),其作用是增加Bcl-2 的表達(dá),從而提高Bcl-2/ Bax 的比值,減少神經(jīng)細(xì)胞走向凋亡,進(jìn)而保護(hù)損傷的脊髓神經(jīng)組織〔10〕。王金光等〔11〕證實β-七葉皂甙鈉改善血循環(huán),中止SCI 繼發(fā)性損傷,抑制脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥表達(dá)的機(jī)制之一是上調(diào)Bcl-2 表達(dá)；還有研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物( EGb)能抑制SCI后細(xì)胞凋亡,在運(yùn)動功能恢復(fù)、損傷脊髓組織保護(hù)上發(fā)揮其有益作用,其機(jī)制之一也是上調(diào)Bcl-2 和下調(diào)Bax 基因表達(dá)〔12～14〕。

本實驗提示外源性BDNF很可能是通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)來參與急性脊髓損傷的發(fā)病機(jī)制的。

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