王 宇 王 燕 王 波 史小琴 張明艷 張建麗 許文杰

(河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071002)

腦梗死是嚴重威脅人類健康的疾病之一，其致殘和致死率均較高〔1〕。目前治療手段無法修復(fù)或逆轉(zhuǎn)壞死的腦組織，更不能促進血管和神經(jīng)再生，且因適應(yīng)證和并發(fā)癥的限制，溶栓治療并未取得良好療效。缺血性梗死雖然誘導(dǎo)內(nèi)源性干細胞增殖，但產(chǎn)生的自身修復(fù)作用有限。本課題組利用細胞因子(趨化因子)使骨髓干細胞進入外周血，并在特定的組織微環(huán)境下分化為受損細胞的特性〔2〕，達到修復(fù)缺血損傷的作用。本研究利用重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)動員骨髓干細胞治療大鼠腦梗死模型，探討骨髓干細胞能否在腦梗死的特定環(huán)境中發(fā)揮保護作用并促進血管新生，為治療腦梗死尋找更有效的治療方法提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實驗動物與分組 健康雄性SD大鼠(清潔級)共150只，體重300～400 g。在SPF恒溫恒濕條件下飼養(yǎng)，并隨機分為模型動員組、模型組、假手術(shù)組，每組50只。在大腦中動脈閉塞模型建立后，于24、48、72 h、1 w和1個月五個不同時間點對各組的10只(n=10)大鼠分別處死。在處死前對不同時點的各組10只大鼠進行神經(jīng)功能Longa評分〔3〕。

1.2主要藥物與試劑 rhG-CSF：武漢博士德生物工程有限公司；抗大鼠CD34、VEGF和Flk-1單抗：北京中杉科技有限公司；抗大鼠Ⅷ單抗：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3大腦中動脈閉塞模型的建立 在無菌條件下，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉SD大鼠。取仰臥位固定和消毒術(shù)野，頸正中線切口并分離左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)，在CCA遠心和近心端及ECA掛線備用；用微動脈夾夾閉ICA，近心端結(jié)扎CCA、ECA；在距CCA分叉處3～5 mm剪一小口，將拴線插入到CCA，這時用繞在CCA遠心端的細線輕輕系牢拴線。用眼科鑷輕推拴線，從血管分叉處開始算距離，當插入深度在18 mm時，送線至剛有阻力感時停止進線，緊緊系牢CCA遠心端的細線，扎緊切口處之活結(jié)備線，外留1 cm長線頭，縫合皮膚。Longa評分：再灌注2 h后，按照5分法分級(0分：無神經(jīng)缺損癥狀；1分：對側(cè)前肢不能完全伸直；2分：向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自己行走或昏迷)。1～4分為大鼠模型成功建立的標志。

1.4檢測指標 腹腔注入過量麻醉劑致死后，碘酒和酒精消毒，快速斷頭并將頭皮充分分離；然后從近頸部開始分離頭骨，咬骨鉗迅速掀去顱骨，眼科剪分離神經(jīng)，最后將大腦完整分離。腦梗死面積：腦組織冷凍后選取肉眼下梗死明顯部分制成蘇木素-伊紅(HE)染色組織病理切片，每只大鼠制作3張，光學(xué)顯微鏡下記錄最大梗死灶長度及寬度，長度×寬度即為梗死灶面積。微血管密度：以Ⅷ因子陽性表達為微血管所在區(qū)域，主要發(fā)生在梗死灶周圍。免疫組化結(jié)果均使用image pro-plus軟件進行分析。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)功能分級 骨髓干細胞動員后24 h，模型組與模型動員組Longa評分未見明顯差異(P>0.05),但均優(yōu)于假手術(shù)組；在48 h、72 h、1 w和1個月后，模型動員組明顯優(yōu)于模型組(P<0.05)，而假手術(shù)組未見明顯神經(jīng)功能改善；且模型動員組改善情況更為明顯(P<0.05)。見表1。

2.2腦梗死面積測定 假手術(shù)組未見梗死區(qū)，模型組和模型動員組梗死面積均大于假手術(shù)組(P<0.05)；而模型動員組梗死面積不同時間點均小于模型組(P<0.05)；且發(fā)現(xiàn)兩組在不同時間梗死面積變化趨勢各異，模型組呈緩慢增加，而模型動員組逐漸減少，且在72 h和1 w時間點梗死面積與前一時間點比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3微血管密度 兩組微血管密度均大于假手術(shù)組(P<0.05)；模型動員組在各時間點均表達大于模型組(P<0.05)；且在模型動員組中發(fā)現(xiàn)，48 h比24 h時間點的Ⅷ因子表達明顯增加(P<0.05)。見表3。

表1 各組不同時間點Longa評分比較

表2 各組不同時間點腦梗死面積比較

表3 各組不同時間點Ⅷ因子表達情況比較

3 討 論

雖然機體在腦缺血應(yīng)激狀態(tài)下可促進生成微血管，本實驗也證實了這點，但遠不能達到治療和改善病情的目的，且目前治療方式局限，不能得到很好的治療效果。血管內(nèi)皮系統(tǒng)是血管新生的根本途徑，而血管生成因子參與的信號傳導(dǎo)起決定性作用〔4〕。

粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是調(diào)節(jié)骨髓粒系造血的重要細胞因子。體外實驗發(fā)現(xiàn)G-CSF可誘導(dǎo)中性粒細胞分泌血管生成因子〔5〕。大鼠經(jīng)G-CSF治療后內(nèi)皮細胞增殖和梗死區(qū)血管密度均顯著高于對照組，且其具有同時動員造血干細胞和間充質(zhì)干細胞的能力，所以G-CSF動員骨髓造血干細胞的同時也動員了內(nèi)皮前體細胞〔6〕。實驗證明，G-CSF在體內(nèi)、體外均可促進內(nèi)皮前體細胞的生長、增殖和遷移，從而增加缺血區(qū)域組織的血管新生〔7〕。因此，應(yīng)用骨髓干細胞動員治療腦梗死成為可能。本研究發(fā)現(xiàn)，使用了rhG-CSF的模型動員組無論在血管新生、微血管密度、梗死面積，還是神經(jīng)功能等方面均有明顯改善，但隨治療時間推移，血管新生不能看到明顯的變化，這可能與機體對藥物抵抗等有關(guān)，但具體機制有待進一步研究。陳運賢等〔8〕用G-CSF動員自體骨髓干細胞治療大鼠急性腦梗死的實驗發(fā)現(xiàn)，G-CSF治療梗死體積明顯小于對照組,病理損傷也輕于對照組，提示G-CSF動員可能對缺血性腦梗死有保護作用，術(shù)后48 h在腦梗死灶中只發(fā)現(xiàn)CD34陽性的單個核浸潤，這一結(jié)果也與本研究一致。腦梗死的干細胞動員，其具體治療效果還需大量實驗和臨床研究來證實。

4 參考文獻

1Kalaria RN. Cerebrovascular disease and mechanisms of cognitive impairment: evidence from clinicopathological studies in humans〔J〕. Stroke,2012;43(9): 2526-34.

2靳鳳艷,邱錄貴,李橋川,等. 基質(zhì)細胞衍生因子-1及其受體在G-CSF誘導(dǎo)的造血干/祖細胞動員中的作用〔J〕. 中華血液學(xué)雜志,2007;28(2)：98-102.

3賽音巴雅爾,林貴軍,饒芝國. 外源性血管內(nèi)皮生長因子對大鼠腦血腫周圍血管新生及神經(jīng)功能恢復(fù)的影響〔J〕. 中華神經(jīng)外科雜志,2012;28(5)：522-5.

4Emanueli C,Madedu P. Angiogenesis gene therapy to rescue ischaemic tissues: achievements and future directions〔J〕. Br J Pharmacol,2001;133(7): 951-8.

5Ohki Y,Heisssig B,Sato Y. Granulocyte colony-stimulating factor promotes neovascularization by releasing vascular endothelial growth factor from neutrophils〔J〕. FASEB J,2005;19(14): 2005-7.

6Lee ST,Chu K,Jung KH,etal. Cranulocyte colony-stimulating factor enhances angiogenesis after focal cerebral ischemia〔J〕. Brain Res,2005;1058(1-2): 120-8.

7劉宏偉,蓋魯粵,張端珍,等. 骨髓干細胞動員與移植治療心肌梗死的比較〔J〕. 中國病理生理雜志,2006;22(4):674-7.

8陳運賢,陸 英,鐘雪云,等. 粒細胞集落刺激因子動員骨髓干細胞治療大鼠缺血性腦梗死〔J〕. 中國病理生理雜志,2004;20(4):560-5.