邢 磊 焦穎華 田發(fā)明

(河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科，河北 唐山 063000)

糖尿病腎病(DN)是終末期腎病的主要病因，并且是糖尿病(DM)患者死亡的主要原因之一〔1，2〕。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成及降解失衡在DN腎小球硬化中發(fā)揮重要作用〔3，4〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)系統(tǒng)是參與ECM降解的主要酶系，本研究旨在探討解聚復(fù)腎寧(JJFSN)對(duì)DM大鼠腎組織MMP-9及TIMP-1表達(dá)的影響，以探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥物及試劑 鏈脲佐菌素(STZ)為ALEXIS公司產(chǎn)品；JJFSN由黃芪、生地黃、黃連、黃芩、丹參、葛根等12味中藥組成，制備成濃縮口服液，含生藥2 g/ml；厄貝沙坦為杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司產(chǎn)品。MMP-9、TIMP-1兔多克隆抗體、山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體免疫組化檢測(cè)試劑、DAB顯色劑均為北京中杉金橋有限公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組、模型的建立及給藥 選擇8 w齡體重200～220 g的健康雄性SD大鼠70只。用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常對(duì)照組10只和造模組60只。造模組用0.1 mmol/L無菌枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.2，4℃)將STZ配成2%的溶液，大鼠禁食12 h后，按STZ 60 mg/kg劑量，左下腹腔單次注射。注藥后72 h尾尖取血測(cè)空腹血糖(FPG)，血糖≥16.65 mmol/L者確定為DM成模大鼠，共成模51只。將成模DM大鼠隨機(jī)分成4組：模型組13只、JJFSN組13只、厄貝沙坦組12只、JJFSN+厄貝沙坦組13只。正常對(duì)照組大鼠腹腔注射等量無菌枸櫞酸鈉緩沖液，尾尖取血測(cè)血糖，血糖4.7～8.3 mmol/L者為正常，共10只。造模7 d后，JJFSN組用JJFSN按14.9 ml·kg-1·d-1灌胃；厄貝沙坦組用厄貝沙坦按50 mg·kg-1·d-1灌胃；解聚復(fù)腎寧+厄貝沙坦組用解聚復(fù)腎寧按14.9 ml·kg-1·d-1和厄貝沙坦按50 mg·kg-1·d-1灌胃。每日上午1次，正常對(duì)照組和模型組大鼠每日上午用等量蒸餾水灌胃。室溫18～20℃，相對(duì)濕度69%，12 h交替照明，大鼠自由飲水、進(jìn)食。共喂養(yǎng)12 w。

1.2.2標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d，用代謝籠留取24 h尿液，記錄總量，離心，-80℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，所有動(dòng)物于空腹?fàn)顟B(tài)稱體重(BW)，10%水合氯醛腹腔麻醉，心臟取血，分離血清，-80℃冰箱保存；剖腹分離雙側(cè)腎臟，右腎用冰生理鹽水清洗，吸干水分，稱腎重(KW)，左腎取少部分皮質(zhì)制備1 mm3數(shù)塊，用4%戊二醛固定，待做透射電鏡觀察，取1/2腎組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，待行病理和免疫組化。

1.2.3生化指標(biāo)檢測(cè)方法 血糖、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、24 h尿白蛋白排泄率(UAER)用ROCHE MODULAR全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

1.2.4免疫組織化學(xué)方法 將石蠟包埋的腎組織制成厚4 μm切片，按照免疫組化二步法檢測(cè)腎組織MMP-9、TIMP-1的表達(dá)。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。每個(gè)標(biāo)本在400倍光鏡下隨機(jī)選取8個(gè)視野，采用Olympus公司圖像采集系統(tǒng)及北航醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，染色陽(yáng)性部位的深淺以平均光密度值表示。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般狀態(tài)、BW、KW/BW和FPG比較 見表1。成模大鼠均出現(xiàn)多飲、多食、多尿、消瘦、毛發(fā)枯黃無光澤等DM表現(xiàn)，部分出現(xiàn)肢體感染、潰瘍和白內(nèi)障等并發(fā)癥。模型組大鼠上述癥狀明顯，死亡3只，考慮死因?yàn)檠沁^高引起酮癥酸中毒或感染，JJFSN組、厄貝沙坦組、JJFSN+厄貝沙坦組大鼠上述癥狀較輕，JJFSN組、厄貝沙坦組、JJFSN+厄貝沙坦組因灌胃各死亡2只。

2.2各組大鼠BUN、Scr和UAER比較 見表2。模型組與正常對(duì)照組比較，BUN、Scr、UAER均顯著增高，JJFSN組、厄貝沙坦組、JJFSN+厄貝沙坦組與模型組比較，BUN、Scr、UAER均明顯降低，JJFSN+厄貝沙坦組降低最顯著(P<0.01)，JJFSN組與厄貝沙坦組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3各組大鼠腎臟形態(tài)學(xué)觀察 電鏡下，正常對(duì)照組大鼠足突細(xì)長(zhǎng)整齊，基底膜厚度適中；模型組大鼠腎臟系膜區(qū)可見高電子密度沉積物，基底膜明顯增厚,足突融合；JJFSN組、厄貝沙坦組、JJFSN+厄貝沙坦組上述改變明顯輕于模型組。

2.4各組大鼠MMP-9、TIMP-1表達(dá) 見表2。正常對(duì)照組大鼠腎組織中均有明顯MMP-9表達(dá)，在腎小球、腎小管及間質(zhì)可見明顯的棕黃色強(qiáng)陽(yáng)性染色區(qū)；模型組MMP-9僅為弱陽(yáng)性表達(dá)；JJFSN組MMP-9的表達(dá)較DM模型組強(qiáng)，為陽(yáng)性表達(dá)，但較正常對(duì)照組弱，JJFSN組與厄貝沙坦組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，JJFSN+厄貝沙坦組較JJFSN組、厄貝沙坦組表達(dá)上調(diào)更為顯著(P<0.01)。TIMP-1在正常對(duì)照組大鼠腎組織中可見少量棕黃色染色，為弱陽(yáng)性表達(dá)；在模型組，腎小球、腎小管及間質(zhì)均可見大量棕黃色染色，TIMP-1表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性：JJFSN組TIMP-1的表達(dá)較正常對(duì)照組強(qiáng)，但較DM模型組弱，為陽(yáng)性表達(dá)，JJFSN組與厄貝沙坦組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，JJFSN+厄貝沙坦組較其他治療組表達(dá)下調(diào)更為顯著(P<0.01)。

表1 12 w后各組大鼠FPG、BW、KW、KW/BW變化情況

表2 12 w后各組大鼠BUN、 Scr、 UAER及腎組織MMP-9、TIMP-1平均光密度值

3 討 論

DM是以高血糖為特征的內(nèi)分泌代謝性疾病，DM及其慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，與眾多細(xì)胞因子和酶活性的改變有關(guān)，DM導(dǎo)致的代謝異?？梢鸹啄そY(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，這些改變可使組織血管基底膜的降解與重構(gòu)機(jī)制發(fā)生異常，而ECM作為血管壁的主要成分在這些生理病理過程中發(fā)揮重要作用。正常情況下，ECM處于不斷產(chǎn)生和不斷降解的動(dòng)態(tài)平衡中，涉及ECM代謝最主要的酶系是MMPs/ TIM Ps。MMPs是一組具有類似結(jié)構(gòu)和共同生物化學(xué)性質(zhì)的金屬依賴性蛋白水解酶超基因家族，是ECM的主要降解酶系統(tǒng)，能降解除多糖以外的所有ECM成分，如膠原和彈性蛋白，其活性受TIMPs的調(diào)節(jié)。TIMPs為MMPs特異性組織抑制因子，能特異性與MMPs催化中心的Zn2+結(jié)合，封閉其催化活性。MMPs調(diào)節(jié)紊亂與DM的發(fā)生密切相關(guān)。生理狀態(tài)下MMPs/TIMPs處于一種動(dòng)態(tài)平衡，共同維持ECM的正常代謝，而在DN時(shí)，由于高血糖、血脂代謝紊亂及蛋白非酶促糖基化作用等，這種平衡被打破，導(dǎo)致TIMPs表達(dá)上調(diào)和或MMPs表達(dá)下調(diào)，均可致ECM的合成增加，降解減少，而堆積〔5〕。其他細(xì)胞因子如TGF-β1不但可刺激基質(zhì)成分合成增加，也可通過上調(diào)TIMPs表達(dá)、抑制MMPs表達(dá)，或使其活性降低，影響細(xì)胞外基質(zhì)的正常代謝，導(dǎo)致ECM的積聚〔6〕。

而在眾多MMPS家族成員中，MMP-9能夠降解腎臟組織明膠和基底膜膠原，TIMP -1是MMP-9特異性的抑制因子，因此MMP-9及TIMP-1可能與DN的發(fā)生、發(fā)展最相關(guān)。研究認(rèn)為，MMP-9可能通過兩種機(jī)制導(dǎo)致腎小球損傷：①誘導(dǎo)系膜細(xì)胞由靜止表型轉(zhuǎn)變?yōu)檠装Y表型，出現(xiàn)快速增殖，表達(dá)新型蛋白，合成ECM增多，導(dǎo)致系膜基質(zhì)堆積〔7〕；②可降解基底膜，破壞細(xì)胞與基質(zhì)的正常連接，致腎小球正常結(jié)構(gòu)破壞，影響腎小球ECM的重塑，促進(jìn)蛋白尿的發(fā)生〔8〕。TIMP-1與MMP-9以1：l比例非共價(jià)鍵結(jié)合形成MMP-9-TIMP-1復(fù)合體，阻斷MMP-9與底物的結(jié)合和活化，兩者共同參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程〔9〕。Karamessinis等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下人類近端腎小管上皮細(xì)胞中MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表達(dá)下降，TIMP-1 mRNA表達(dá)升高，且2型糖尿病(T2DM)伴蛋白尿患者M(jìn)MP-9和MMP-2釋放減少，表明局部MMP/TIMP失衡參與DM腎組織的重建過程。研究證實(shí)，重組人結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(rhCTGF)可增加組織金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1、TIMP-3(尤其是TIMP-1)的表達(dá)，然而TIMP-1的增多則會(huì)抑制MMP-9的作用，從而阻止細(xì)胞外基質(zhì)的降解〔11〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DM大鼠MMP-9在腎組織中表達(dá)明顯下調(diào)， TIMP-1表達(dá)上調(diào)，與Mc Lennan等〔7〕研究結(jié)果一致。機(jī)制可能是腎組織中MMP-9的表達(dá)在模型組明顯下調(diào)，而TIMP-1的表達(dá)在DM模型組明顯上調(diào)，形成病理狀態(tài)下新的平衡，這種新的平衡狀態(tài)導(dǎo)致MMP-9對(duì)ECM的降解減少，促使ECM在DM大鼠腎小球內(nèi)的積聚，從而導(dǎo)致腎小球硬化，促使DN的發(fā)生和發(fā)展。解聚復(fù)腎寧可能是通過下調(diào)TIMP-1表達(dá)及上調(diào)MMP-9表達(dá)，促進(jìn)腎小球細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而達(dá)到延緩腎小球硬化的作用，其治療作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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