宓 丹 馬賢德 王 建

(遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，遼寧 沈陽 110034)

干預腦缺血后炎性反應的某些環(huán)節(jié)，減少神經(jīng)元凋亡，已成為腦梗死治療的重要環(huán)節(jié)〔1〕。核因子(NF)-κB是一種重要的轉錄因子，激活后的NF-κB可高效誘導多種細胞因子、黏附分子和趨化因子表達，同時對參與炎癥反應放大與延續(xù)(即級聯(lián)瀑布效應)的多種酶的基因表達也具有重要的調(diào)控作用〔2〕。血管細胞黏附分子(VCAM)-1屬于黏附因子，與腦缺血再灌注損傷的炎癥機制密切相關。本實驗通過探討眼針對NF-κB p65，VCAM-1表達的影響闡述眼針對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 健康SPF級SD大鼠40只，雌雄不拘，體重(280±20) g，由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供，許可號：SCXK(滬)2008-0016。隨機數(shù)字法將大鼠分為對照組、假手術組、模型組、眼針組4組，每組10只。

1.2模型制備與評價 參照文獻〔3〕，模型組及眼針組采用改良的線栓法復制大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型。模型成功標準：大鼠于缺血2 h后進行再灌注，再灌注后進行神經(jīng)功能缺損評分，參照Longa 5分制評分標準〔4〕：0分為無癥狀；1分為不能完全伸展對側前爪；2分為向對側轉圈；3分為向對側傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。評分為1～3分者納入實驗組，未達標準者排除。假手術組術式同模型、眼針組，區(qū)別在于釣魚線插入深度為0.5～1 cm。正常組未做處理。

1.3眼針取穴及刺法 眼針組：用31號13 mm毫針，于大鼠眶周2 mm處針刺，定位參照人體取穴方法〔5〕，取肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)針刺。手法：平刺，進針3 mm。留針20 min，留針期間捻轉行針3次，每次1 min。治療時機：眼針組于腦缺血再灌注即刻針刺1次，動物存活期每12 h進針1次，最后1次進針30 min后取材。

1.4主要試劑 NF-κB p65、 VCAM-1一抗(武漢博士德)，SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德)，抗原修復液(北京博奧森)，其余試劑由遼寧中醫(yī)藥大學實驗室提供。

1.5標本采集與處理 動物完成觀察時間后，以10%水合氯醛按標準量麻醉大鼠，開胸暴露心臟，將灌注針頭從心尖部位插入心臟，剪開右心耳，依次迅速灌注20 ℃的0.9%生理鹽水200 ml、4 ℃的4%多聚甲醛200 ml，灌畢迅速取腦，在視交叉平面前后2 mm處將腦冠狀切面切開，留取中間部分置于4 ℃的4%多聚甲醛固定液中過夜。常規(guī)上行脫水、透明后用石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚5 μm，每隔10張取一張，使每一張切片上都有海馬。

1.6指標檢測 免疫組化(SABC法)檢測。切片脫蠟至水，抗原修復液修復，滴加封閉液，滴加1∶100兔抗鼠抗體，過夜，加SABC。DAB顯色、復染、脫水、透明，封片。采用全自動彩色圖像處理系統(tǒng)進行圖像分析，每只大鼠隨機選取3張非連續(xù)的腦片，在×400鏡下，計數(shù)VCAM-1，NF-κB p65陽性細胞數(shù)。觀察免疫組織化學檢測結果陽性反應為細胞質(zhì)或細胞核的棕黃色深染。

2 結 果

2.1眼針對腦缺血再灌注損傷24 h后大鼠神經(jīng)缺損評分影響 模型組和眼針組大鼠均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙，假手術組大鼠無神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)。模型組造模后即刻與眼針組造模后即刻神經(jīng)功能缺損評分無差異(2.1±0.56,2.2±0.78，P>0.05)，模型組24 h后神經(jīng)功能障礙加重，眼針組24 h后與模型組比神經(jīng)功能缺損評分有差異(2.0±0.66,2.2±0.78，P<0.05)。

2.2眼針對腦缺血再灌注損傷24 h后大鼠海馬組織NF-κB p65及VCAM-1蛋白表達的影響 表1可見，缺血再灌注模型組中，海馬組織VCAM-1值同假手術組比較明顯增加(P<0.01)，表明腦缺血再灌可使缺血側海馬的VCAM-1增強。眼針組與模型組比較，則明顯減少缺血側海馬VCAM-1表達(P<0.05)，表明眼針可顯著抑制VCAM-1的表達。缺血再灌注模型組中，NF-κB p65值同假手術組比較明顯增加(P<0.01)，表明腦缺血再灌可使海馬組織的NF-κB p65表達上調(diào)。眼針組與模型組比較，則明顯抑制了NF-κB p65的表達水平(P<0.05)，也表明眼針可顯著下調(diào)NF-κB p65在海馬組織的表達水平。見圖1。

表1 眼針對NF-κB p65及VCAM-1蛋白表達的影響

NF-κB p65對照組

NF-κB p65 模型組

NF-κB p65眼針組手術

NF-κB p65假手術

VCAM-1對照組

VCAM-1假手術組

VCAM-1 模型組

VCAM-1眼針組

3 討 論

腦缺血再灌注后腦組織促發(fā)的炎癥反應是造成腦缺血再灌注損傷的主要原因之一，缺血性腦損傷的炎癥反應是由多種細胞因子介導的一種連鎖過程。打斷這種炎癥的連鎖反應，是目前研究治療腦缺血再灌注損傷的重點。 NF-κB最初是從B細胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種能與免疫κ輕鏈基因的增強子κB序列特異結合的蛋白因子〔6〕，是一種重要的轉錄因子，廣泛存在于真核細胞中，可被許多因素如細胞因子、氧化劑等激活，進而參與多種基因的表達調(diào)控。NF-κB屬于Rel蛋白家族，有5種亞單位:RelA(p65)、RelB、c-Rel、pl05/P50(NF-κBl)和P100/p52(NF-κB2)。p65組成的同源或異源二聚體是NF-κB主要活性形式，在激活靶基因轉錄過程中起著重要作用〔7〕。近年發(fā)現(xiàn)，轉錄因子NF-κB與炎癥反應密切相關，活化的NF-κB可直接調(diào)控參與腦缺血再灌后炎性損傷的多種介質(zhì)基因的表達，例如ICAM-1、E選擇素、VCAM-1、白細胞介素(IL)-1、IL-8、IL-6、TNF-α、COX-2〔8〕。王擁軍等〔9〕應用大鼠MACO模型，運用免疫組化方法檢測NF-κB的免疫活性，發(fā)現(xiàn)缺血2 h后就可見到p65的表達，在12 h達高峰，從24 h開始逐漸衰減。在此過程中，p65免疫活性細胞遍及紋狀體和大腦皮質(zhì)缺血區(qū)，而且p65普遍存在于胞核和胞質(zhì)，說明腦缺血后NF-κB被激活，活化的NF-κB由細胞質(zhì)向細胞核移位。Liu等〔10〕研究表明，大鼠永久性大腦中動脈阻塞后缺血皮質(zhì)區(qū)細胞胞質(zhì)或胞核內(nèi)NF-κB表達增強，使用Oxymatrine后NF-κB表達降低，腦梗死病灶減小。Zhang等〔11〕發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血的同時經(jīng)腦室注射前列腺素，能夠抑制NF-κB p65亞單位的表達，起到保護神經(jīng)元的作用。以上研究均提示，通過抑制NF-κB p65表達來減少細胞凋亡，可能是治療腦缺血再灌注損傷的機制之一。

腦缺血再灌注損傷時，白細胞過度的黏附滾動和牢固黏附進而向血管外游走，釋放蛋白酶及毒性氧化物，促進炎癥反應，導致腦組織缺血再灌注損傷，VCAM-1作為介導白細胞與血管內(nèi)皮細胞黏附的重要因子在這一過程中起重要作用。正常情況下VCAM-1低水平存在于血管內(nèi)皮細胞膜上，受致炎因子刺激時表達增加。VCAM-1的表達能使白細胞釋放更多炎性介質(zhì)和細胞因子，后者又增加VCAM-1表達，兩者互為正反饋作用，從而加重腦缺血再灌注后的炎癥反應，形成惡性循環(huán)〔12〕。張莉莉等〔13〕發(fā)現(xiàn)應用抗VCAM-1單克隆抗體后，缺血區(qū)微動脈內(nèi)白細胞附壁密度指數(shù)有顯著性降低，局部腦組織中白細胞聚集和神經(jīng)元損傷也有明顯減輕，提示抗VCAM-1單克隆抗體可起到一定的缺血性腦保護作用。

本實驗結果說明缺血、缺氧可以促進NF-κB p65，VCAM-1的表達，而眼針可能通過下調(diào)NF-κBp 65水平表達，抑制腦梗死后腦微血管內(nèi)皮細胞表面VCAM-1的表達，從而減少中性粒細胞在缺血區(qū)腦組織募集浸潤，抑制炎癥介質(zhì)釋放，阻斷了炎癥反應惡性循環(huán)，保護缺血腦組織，其具體的作用機制仍需深入探討。

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