劉 平 劉東慧 付秀美 陳志宏

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

既往關(guān)于2型糖尿病的研究多集中于胰島β細(xì)胞，鮮有研究報(bào)道除胰島β細(xì)胞以外其他胰島細(xì)胞的功能狀態(tài)及與β細(xì)胞之間的關(guān)系。神經(jīng)肽Y(NPY)是從豬腦中提取的含36個(gè)氨基酸的多肽，屬胰多肽家族成員，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的器官和組織，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的多項(xiàng)生理功能〔1,2〕。NPY在哺乳動(dòng)物胰島中主要由α細(xì)胞表達(dá)〔3〕。本研究通過觀察彩色蠶繭水提取物——絲膠對糖尿病模型大鼠胰島α細(xì)胞NPY蛋白表達(dá)的影響，探討絲膠對2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇及分組處理 36只3月齡清潔級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g(合格證號：712024)，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。隨機(jī)選取其中的12只作為正常對照組，常規(guī)飼養(yǎng)，腹腔注射同等劑量鏈脲佐菌素(STZ)溶劑(pH4.4的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液)3次(1次/d)；其余的24只大鼠小劑量STZ連續(xù)腹腔注射(2% STZ，25 mg/kg，3 d)，7 d后檢測空腹血糖，以≥16.7 mmol/L作為2型糖尿病動(dòng)物模型成功的標(biāo)準(zhǔn)〔4〕；然后再隨機(jī)分為糖尿病模型組和絲膠治療組，絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃35 d，正常對照組、模型組大鼠灌胃給予同等劑量的生理鹽水35 d。

1.2藥物與試劑 STZ，美國Sigma公司；血糖檢測試劑盒，保定長城臨床試劑有限公司；兔抗NPY多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司。絲膠為彩色蠶繭經(jīng)浸泡、水煎、過濾、濃縮而成，彩色蠶繭由承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所提供。

1.3檢測血糖 4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)內(nèi)眥取血，3 000 r/min離心20 min后分離血清，-20℃保存。采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖。

1.4檢測胰島細(xì)胞NPY蛋白的表達(dá) 大鼠取血后斷頭處死，取胰腺用Bouins液固定后常規(guī)石蠟包埋，Leica石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，片厚5 μm。免疫組化SP法觀察胰島細(xì)胞NPY的表達(dá)：一抗稀釋濃度為1∶50，4 ℃孵育過夜；二抗(工作液)37 ℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。以PBS代替一抗作為陰性對照，以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。NPY免疫陽性結(jié)果定量分析：采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)在顯微鏡下(10×40)對免疫組化陽性結(jié)果進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取胰島作為觀察視野，計(jì)算陽性產(chǎn)物面積占胰島面積的比值。每組隨機(jī)選取5只大鼠，每只大鼠任選5張切片，每張切片選取3個(gè)胰島，取平均值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠的血糖 糖尿病模型大鼠的血糖明顯高于正常對照組大鼠(P<0.01)；絲膠治療組大鼠的血糖明顯低于糖尿病模型大鼠(P<0.01)。見表1。

2.2各組大鼠胰島細(xì)胞NPY的表達(dá) NPY蛋白免疫陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒狀，位于胰島α細(xì)胞胞質(zhì)。與正常對照組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠胰島α細(xì)胞NPY蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.01)；絲膠治療組大鼠胰島α細(xì)胞NPY蛋白的表達(dá)明顯低于糖尿病模型組大鼠(P<0.01)。見表1，圖1。

表1 各組大鼠的血糖和胰島α細(xì)胞NPY的表達(dá)

正常對照組

糖尿病模型組

絲膠治療組

3 討 論

蠶繭為蠶蛾的繭殼，性甘、溫，無毒，可滋陰潤燥、生精止渴，主治多飲、不生肌肉、腎消白濁和上中二消。民間有蠶繭泡水降血糖的驗(yàn)方，本課題組的前期研究亦發(fā)現(xiàn)，絲膠(彩色蠶繭水提取物)可明顯降低血糖和調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂，保護(hù)糖尿病時(shí)胰島細(xì)胞損傷和性腺功能障礙〔5～7〕。

NPY與多食、多飲、生長發(fā)育遲緩等病理生理過程有關(guān)，并且參與糖尿病微血管病變、腎臟病變及視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展〔8〕。NPY由胰島α細(xì)胞合成和分泌，可通過自分泌和旁分泌的方式調(diào)節(jié)胰島素的分泌〔9〕。有研究發(fā)現(xiàn)，NPY與胰島β細(xì)胞分泌的胰島素間存在著反饋調(diào)節(jié)機(jī)制：NPY可抑制β細(xì)胞分泌胰島素，β細(xì)胞分泌的胰島素反過來通過旁分泌作用抑制NPY的合成和分泌〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠胰島α細(xì)胞NPY的表達(dá)明顯升高。糖尿病時(shí)胰島β細(xì)胞分泌胰島素的水平降低，因而對NPY的反饋抑制作用減弱，導(dǎo)致NPY合成和分泌增多；增多的NPY又抑制胰島素的分泌，使胰島素的分泌進(jìn)一步減少，從而產(chǎn)生惡性循環(huán)〔11〕。同時(shí)，還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)NPY具有較強(qiáng)的縮血管效應(yīng)，可增加血管外周阻力，因此認(rèn)為糖尿病時(shí)NPY表達(dá)增加是導(dǎo)致糖尿病微血管病變的重要原因之一〔12,13〕。由此可見，NPY的高表達(dá)與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

絲膠為蠶繭中約占30%的具有多種生物活性的水溶性蛋白質(zhì)，其中的氨基酸以絲氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等為主，在傳統(tǒng)對蠶繭的應(yīng)用中多作為廢料丟棄。本研究通過浸泡、水煎、過濾、濃縮獲取絲膠蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)絲膠治療組大鼠胰島α細(xì)胞NPY的表達(dá)明顯低于糖尿病模型組大鼠，表明絲膠可通過下調(diào)胰島α細(xì)胞NPY蛋白的表達(dá)，減弱NPY蛋白高表達(dá)對胰島β細(xì)胞分泌胰島素的抑制作用，并減弱NPY的縮血管效應(yīng)，進(jìn)而改善糖尿病及其并發(fā)癥的癥狀。絲膠是天然的蛋白質(zhì)，可避免化學(xué)合成藥物帶給人體的副作用，因此可能具有良好的推廣應(yīng)用前景，但相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步的深入研究。

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