魏 倩 武月婷 侯雨菲 高 影

(吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021)

胰島素抵抗在糖尿病(DM)的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，在Ⅰ型、Ⅱ型DM中均存在〔1，2〕，因此單純通過(guò)注射胰島素治療DM并不能最大程度改善機(jī)體的代謝情況。氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致酪氨酸磷酸酶類(lèi)的失活〔3〕，使胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路出現(xiàn)異常，從而產(chǎn)生胰島素抵抗〔4〕。因此，改善機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，可以在一定程度上改善機(jī)體的胰島素抵抗。天然藥物黃芪具有很好的抗氧化作用〔5，6〕。本研究擬探討黃芪通過(guò)改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)從而改善胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 成年Wistar雄性大鼠，質(zhì)量為(200±10)g，購(gòu)于北京華阜康生物科技有限公司。鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)；黃芪注射液由黑龍江珍寶島制藥公司生產(chǎn)；魚(yú)精蛋白鋅胰島素注射液由江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)(批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H10890001)，4℃保存。糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司?？沽姿峄痗-jun氨基末端激酶(JNK)抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)由中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所提供。抗磷酸化胰島素受體底物(IRS)-1 Ser307和抗p-IRS-1 Tyr612抗體購(gòu)于美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)公司?？笽RS-1、抗肌動(dòng)蛋白(β-actin)、二抗山羊抗兔和二抗兔抗山羊抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2模型復(fù)制、分組及給藥方法 Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，禁食12 h，給予60 mg/kg STZ藥量腹腔注射。STZ溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，溶劑為0.1 mol/L，pH=4.5的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。2 d后尾靜脈采血測(cè)空腹血糖(FBG)值，以FBG≥16.7 mmol/L作為DM模型成功標(biāo)準(zhǔn)，不成功則隔日給予STZ 40 mg/kg進(jìn)行二次注射。若1，3和5 d大鼠FBG值均≥16.7 mmol/L，則DM模型造模成功。將DM模型大鼠隨機(jī)分為模型組(DM組)、黃芪組(RA組)、胰島素組(Ins組)和黃芪加胰島素組(RA+Ins組)，每組6只。另取6只大鼠，腹腔注射等劑量溶劑，作為對(duì)照組。每天10點(diǎn)，給予DM組和對(duì)照組生理鹽水灌胃，RA和RA+Ins組黃芪注射液5 mg/ml灌胃，RA+Ins和Ins組2 U胰島素大腿外側(cè)皮下注射的處理。每3 d檢測(cè)FBG，根據(jù)血糖情況調(diào)整胰島素劑量，使FBG水平在4～8 mmol/L。持續(xù)給藥8 w。自由飲食飲水。

1.3樣本采集及指標(biāo)檢測(cè) 給藥8 w后，禁食，稱(chēng)量大鼠體重。使用10%水合氯醛麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min，1 500 r/min離心10 min，收集血清，-20℃保存?zhèn)溆?。摘取大鼠腎臟和骨骼肌稱(chēng)重后，液氮冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1大鼠腎臟、視網(wǎng)膜AGEs含量的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附法，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)。

1.3.2Western印跡檢測(cè)大鼠骨骼肌中p-SAPK/JNK、p-IRS-1 Ser307和p-IRS-1 Tyr612的表達(dá) 稱(chēng)量大鼠骨骼肌組織 40 mg，加入400 μl RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF)，充分勻漿，4℃靜置30 min，每5 min 震蕩1次。4℃ 14 000 r/min離心5 min，取上清。BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量，操作過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，樣本定量為5 mg/ml。配制分離膠和濃縮膠；在加樣孔中加入30 μg樣品，接通電源，80 V電泳；調(diào)電流至100 mA，轉(zhuǎn)膜120 min；取出PVDF膜，放入裝有10 ml封閉液平皿內(nèi)，室溫輕搖3 h；一抗過(guò)夜；TBST室溫洗膜10 min×3次；二抗1 h；用TBST洗膜10 min×3次；等體積適量ECL A和B液，直接在保鮮膜上混合；將膜取出，用濾紙略吸TBST，置于保鮮膜上；涂勻，用保鮮膜包裹，濾紙吸去多余ECL；將膜固定于暗盒內(nèi)，壓片曝光；顯影定影；用Quantity one軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和SNK檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠腎臟和視網(wǎng)膜AGEs比較 與對(duì)照組比較，其他組大鼠腎臟和視網(wǎng)膜AGEs水平均較高(P<0.05)。與RA和Ins組比較，RA+Ins組腎臟和視網(wǎng)膜AGEs水平顯著較低(P<0.05)，DM組腎臟和視網(wǎng)膜AGEs水平顯著較高(P<0.05)。RA組與Ins組大鼠腎臟和視網(wǎng)膜AGEs水平差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腎臟和視網(wǎng)膜AGEs水平的比較

2.2各組大鼠骨骼肌組織中p-SAPK/JNK的表達(dá) 表2和圖1可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，其他組大鼠骨骼肌中p-SAPK/JNK Thr183的表達(dá)水平顯著較高(P<0.05)。與DM組比較，RA、Ins和RA+Ins組表達(dá)水平顯著較低(P<0.05)，其中RA+Ins組最低，Ins組次之。各組大鼠骨骼肌中p-SAPK/JNK Tyr185的表達(dá)情況與p-SAPK/JNK Thr183相同。

表2 各組大鼠骨骼肌組織中p-SAPK/JNK表達(dá)的比較

圖1 Western印跡檢測(cè)p-SAPK/JNK及p-IRS-1蛋白表達(dá)

2.3各組大鼠骨骼肌組織中p-IRS-1 Ser307和p-IRS-1 Tyr612的表達(dá) 與對(duì)照組相比，組大鼠骨骼肌中p-IRS-1 Ser307的表達(dá)水平顯著較高(P<0.05)。與RA+Ins組比較，DM、RA和Ins組表達(dá)水平顯著較高(P<0.05)，DM組最高，RA組次之。與DM組比較，RA、Ins和RA+Ins組大鼠骨骼肌p-IRS-1 Tyr612的表達(dá)水平顯著較高(P<0.05)；與RA+Ins組比較，RA和Ins組顯著較低(P<0.05)，對(duì)照組顯著較高(P<0.05)。見(jiàn)表3和圖1。

表3 各組大鼠骨骼肌組織中p-IRS-1 Ser307和p-IRS-1 Tyr612表達(dá)的比較

3 討 論

流行病學(xué)資料表明在世界范圍內(nèi)，DM的患病人數(shù)已經(jīng)將近3億，預(yù)計(jì)到2050年患病人數(shù)將達(dá)到3.5億〔7〕。目前，注射胰島素是最為有效的治療方法，但是單純胰島素療法存在很多問(wèn)題，如胰島素注射間隔期血糖波動(dòng)難以控制，胰島素注射時(shí)可能產(chǎn)生的低血糖問(wèn)題〔8〕等。這些問(wèn)題甚至比DM本身更損傷機(jī)體。本研究結(jié)果提示黃芪可以改善DM大鼠機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物水平，緩解胰島素抵抗效應(yīng)，黃芪與胰島素聯(lián)合使用效果最佳。

氧化應(yīng)激是造成胰島素抵抗和DM的重要因素，胰腺本身抗氧化能力弱，大量的活性氧簇(ROS)能夠直接損傷胰島β細(xì)胞〔9〕。機(jī)體的高糖狀態(tài)可以進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激，從而產(chǎn)生惡性循環(huán)。AGEs在DM慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，是由持續(xù)高血糖引起體內(nèi)多種蛋白質(zhì)非酶糖基化產(chǎn)生，可以加劇機(jī)體的氧化應(yīng)激，主要存在于腎臟及視網(wǎng)膜中。本研究結(jié)果提示黃芪和胰島素均可以降低DM大鼠AGEs的水平，改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)。

JNK是絲裂原活化蛋白激酶家族中重要的一員，JNK的激活與炎癥信號(hào)通路和氧化應(yīng)激密切相關(guān)。目前已經(jīng)公認(rèn)JNK可以使IRS-1第307位的絲氨酸磷酸化導(dǎo)致胰島素抵抗〔10〕。IRS-1在胰島素信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起主要作用，在DM患者的骨骼肌中注入胰島素后IRS-1絡(luò)氨酸磷酸化程度明顯低于正常人〔11〕。IRS-1 Ser307磷酸化在介導(dǎo)胰島素負(fù)反饋調(diào)節(jié)方面起重要作用，它不僅可以干擾IRS-1與其受體的結(jié)合而且減少I(mǎi)RS-1酪氨酸的磷酸化，從而使胰島素信號(hào)傳導(dǎo)異常〔12～14〕。本研究顯示，黃芪可以降低p-SAPK/JNK的表達(dá)，從而降低IRS-1 絲氨酸磷酸化程度，使酪氨酸磷酸化程度升高，保證胰島素信號(hào)的傳導(dǎo)，改善胰島素抵抗效應(yīng)。

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