郭瑞娜，李小青，沈之君

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)系，江蘇 南通 226001)

TRPM7是新近發(fā)現(xiàn)的具有離子通道和蛋白激酶雙重結(jié)構(gòu)的雙功能膜蛋白，歸屬于TRPM(transient receptor potential melastatin， 一過性感受器電位通道)超家族。 TRPM7廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物多種組織器官中，參與體內(nèi)鎂離子的平衡與代謝。在某些心臟病患者中，TRPM7功能低下可能影響心室肌的傳導(dǎo)和復(fù)極化[1]。在房顫患者的心房肌細(xì)胞中，TRPM7的功能出現(xiàn)顯著上調(diào)[2]。

AngⅡ通過作用于靶細(xì)胞膜的AT1(AngⅡ的Ⅰ型)或AT2(AngⅡ的Ⅱ型)受體，參與對(duì)血壓及心臟功能的調(diào)節(jié)。血清AngⅡ長期增高可通過系統(tǒng)和局部作用影響心血管功能，引起高血壓、心肌肥大、心肌炎癥、氧化應(yīng)激及纖維化等，在心肌重塑和心功能衰竭中起重要作用[3- 4]。

雖然TRPM7和AngⅡ均參與心肌功能的調(diào)節(jié)，但是兩者之間的關(guān)系迄今尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究探討TRPM7是否參與了AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞鎂離子平衡的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)ICR鼠由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的操作方案及步驟符合南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的規(guī)范和要求。動(dòng)物在密閉的氣室中CO2麻醉后迅速斷頭，開胸取出心臟，用心尖部的心室肌組織作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

取出生1 d小鼠的心尖部組織，D- Hanks液漂洗3遍，用解剖剪將組織剪碎。剪碎的心肌組織加入0.25%胰酶(Trypsine，Invitrogen)，于37 ℃的水浴鍋中孵育10 min,然后加入DMEM培養(yǎng)基終止胰酶的作用，移至離心管中在室溫下離心(1 000 r·min-1，10 min)，棄上清，再次加胰酶進(jìn)行孵育和離心分離，重復(fù)2～3次。將分離好的細(xì)胞在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)1.5 h以減少成纖維細(xì)胞。取未貼壁的細(xì)胞在6孔培養(yǎng)板中進(jìn)一步培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM，細(xì)胞密度約為1×106。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞內(nèi)游離鎂離子動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

取分離的小鼠心肌細(xì)胞，加入有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中進(jìn)行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM液。培養(yǎng)24 h后用D- Hanks漂洗，在低鎂孵育液中孵育4 h后備用。經(jīng)低鎂孵育后的細(xì)胞分對(duì)照組(空白的低鎂孵育液)、AngⅡ組(100 nmol·L-1)、AngⅡ+Losartan組(100 nmol·L-1)及AngⅡ+2- APB組(500 μmol·L-1)，上述試劑均購自Sigma- Aldrich公司，按產(chǎn)品說明書配制后直接加入相應(yīng)的低鎂孵育液中。各組孵育時(shí)間均為2 h。孵育結(jié)束后按鎂離子熒光探針mag- fura- 2產(chǎn)品說明書(Invitrogen)進(jìn)行胞內(nèi)鎂離子標(biāo)記。從熒光探針標(biāo)記到實(shí)驗(yàn)結(jié)束的時(shí)間不超過2 h。

將載有培養(yǎng)細(xì)胞的蓋玻片從6孔板中轉(zhuǎn)移入記錄浴槽，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)鎂離子動(dòng)態(tài)檢測(cè)，記錄浴槽安置在正置顯微鏡的觀察平臺(tái)上(Olympus，BX51)并保持持續(xù)灌流，滴速為40～50滴·min-1。mag- fura- 2鎂離子熒光探針信號(hào)用TTL- 1(Polychrome V，德國)進(jìn)行雙波激發(fā)(波長在340 nm和380 nm之間快速切換)，用CCD相機(jī)(C10600，日本)實(shí)時(shí)觀察和記錄510 nm的熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)存儲(chǔ)于連線的計(jì)算機(jī)硬盤中供離線分析。各組細(xì)胞先在0.2 mmol·L-1低鎂孵育液灌流下觀察胞內(nèi)熒光信號(hào)，待其穩(wěn)定后開始記錄。記錄至120 s后換為1.2 mmol·L-1生理鎂孵育液灌流，再記錄至1 800 s后再換成10 mmol·L-1高鎂孵育液灌流，繼續(xù)記錄1 800 s后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。每個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)時(shí)記作n=1。mag- fura- 2熒光探針應(yīng)用原理是觀察胞內(nèi)熒光探針在340 nm(熒光探針與鈣離子結(jié)合)和380 nm(熒光探針未結(jié)合鈣離子)光源激發(fā)下其510 nm熒光強(qiáng)度比值(340/380比值)的變化來描述胞內(nèi)游離鎂離子濃度的相對(duì)變化，比值升高提示胞內(nèi)游離鎂離子上升，比值下降則提示胞內(nèi)游離鎂離子下降。因此，為了便于組內(nèi)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和組間數(shù)據(jù)的比較，我們把每個(gè)細(xì)胞在0.2 mmol·L-1低鎂孵育液中的340 nm/380 nm比值為基線，分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后再作統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn)。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR

以出生15 d的小鼠心室肌組織或原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞為樣本，用Trizol Reagent it(美國Invitrogen公司) 提取樣本總RNA，用TaqMan Probe Assay kit(日本TaKaRa公司) 在Real- time PCR擴(kuò)增儀(美國ABI)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s。共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火末期檢測(cè)熒光信號(hào))。小鼠TRPM7 PCR引物：上游5′CTGCCAATCTAGGAGAAGATGCAAT3′；下游引物：5′AGGCGTGTAGTCATTCCTCTTCAAA3′。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn)。

1.5 Western Blotting檢測(cè)

將6孔培養(yǎng)板自培養(yǎng)箱內(nèi)取出，置于冰上，用PBS漂洗心肌細(xì)胞后每孔加入100 μl的蛋白裂解液(內(nèi)含1 μl的蛋白酶抑制劑)進(jìn)行處理。然后在4 ℃下進(jìn)行離心(13 000 r·min-1，25 min)，用BCA法測(cè)上清中總蛋白濃度，根據(jù)每個(gè)樣本的總蛋白濃度計(jì)算其上樣量，使各樣本間的總蛋白量保持一致。用10%的PAGE膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用3%的BSA封閉1 h后加Ⅰ抗Rabbit anti- TRPM7 (以色列Alomone公司)，β- actin(美國Abcam公司)；4 ℃過夜后用TBST洗膜3次，每次10 min，然后加Ⅱ抗 (Goat anti- rabbit，美國Santa Cruze公司)后在室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加ECL，用凝膠成像系統(tǒng)顯影。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。凝膠成像使用灰度統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用成組t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞鎂離子平衡的影響

本實(shí)驗(yàn)觀察到，當(dāng)對(duì)照組的0.2 mmol·L-1低鎂孵育液換成1.2 mmol·L-1生理鎂離子孵育液后，胞內(nèi)mag- fura- 2的熒光強(qiáng)度比值出現(xiàn)了先快速小幅度上升，在到達(dá)最大值(1.2 mmol·L-1Peak)后轉(zhuǎn)為緩慢下降，在1.2 mmol·L-1低鎂孵育液結(jié)束前(1.2 mmol·L-1End)基本回到最初的水平。在10 mmol·L-1高鎂孵育液中，這種緩慢下降的趨勢(shì)逐漸消失，在10 mmol·L-1高鎂孵育液結(jié)束前(10 mmol·L-1End)比0.2 mmol·L-1低鎂孵育液的比值略低(圖1A)，各組mag- fura- 2的熒光強(qiáng)度比值平均值見圖1B，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，這些變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1C)。

AngⅡ組mag- fura- 2熒光強(qiáng)度比值在1.2 mmol·L-1及10 mmol·L-1中均呈下降的趨勢(shì)(圖1A)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，這些變化與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且Ang Ⅱ組內(nèi)0.2 mmol·L-1End、1.2 mmol·L-1Peak、1.2 mmol·L-1End、10 mmol·L-1End間比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B、C)。AngⅡ誘導(dǎo)的mag- fura- 2熒光強(qiáng)度比值變化可以分別被Losartan或2- APB抑制(圖1A、B)。AngⅡ+Losartan組和AngⅡ+2- APB組的mag- fura- 2熒光強(qiáng)度比值在不同的細(xì)胞外鎂離子濃度條件下也出現(xiàn)了有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的下降(圖1C)。

aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001

A.各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞內(nèi)mag- fura- 2的熒光強(qiáng)度比值變化實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)平均值；B.各組mag- fura- 2的熒光強(qiáng)度比值平均值;C.各組mag- fura- 2的熒光強(qiáng)度比值平均值

圖1各組動(dòng)態(tài)熒光強(qiáng)度比值

2.2 AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞TRPM7表達(dá)水平的影響

我們觀察到AngⅡ誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞游離鎂離子下降，并且這種下降可以被TRPM7通道阻斷劑2- APB抑制。這就說明了TRPM7可能參與了Ang Ⅱ介導(dǎo)的鎂離子外流。因此，我們進(jìn)一步檢測(cè)了Ang Ⅱ?qū)RPM7表達(dá)量的影響。通過qPCR和Western Blotting方法，我們發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ沒有影響原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞中TRPM7的表達(dá)(圖2)。

A.小鼠原代心肌細(xì)胞TRPM7 mRNA的統(tǒng)計(jì)圖(n=3)；B.小鼠原代心肌細(xì)胞TRPM7蛋白的電泳圖及統(tǒng)計(jì)圖(n=3)

圖2AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞TRPM7表達(dá)的影響

3 討 論

我們應(yīng)用鎂離子熒光探針技術(shù)，首次證明了AngⅡ在原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞中誘導(dǎo)了胞內(nèi)游離鎂離子下降，而阻斷TRPM7通道則可以顯著抑制這種變化。進(jìn)一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞中TRPM7的表達(dá)量沒有影響。因此，我們的研究提示，AngⅡ可能增強(qiáng)了心肌TRPM7通道對(duì)鎂離子的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。有文獻(xiàn)報(bào)道，短時(shí)間(5 min)以AngⅡ孵育野生型大鼠的血管平滑肌細(xì)胞可以導(dǎo)致胞內(nèi)Mg2+濃度顯著降低，長時(shí)間孵育(24 h)則可以觀察到TRPM7依賴的Mg2+內(nèi)流，胞內(nèi)游離Mg2+濃度顯著增加。這種TRPM7依賴性的Mg2+內(nèi)流可能與AngⅡ誘導(dǎo)的胞內(nèi)Mg2+濃度持續(xù)下降所致的TRPM7反饋性表達(dá)增加有關(guān)[5]。而Ang Ⅱ 孵育自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞可誘導(dǎo)TRPM7表達(dá)下降，進(jìn)而出現(xiàn)使胞內(nèi)游離Mg2+顯著降低[6]。此外，我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還顯示，阻斷TRPM7通道并不能完全抑制AngⅡ誘導(dǎo)的鎂離子下降，提示可能有其他鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的參與的可能性。

通過實(shí)驗(yàn)我們還觀察到，使用AT1受體阻斷劑并不能完全抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鎂離子下降。因此，AT1可能參與了AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞鎂離子的調(diào)節(jié)，但也不能排除AT2受體參與AngⅡ 對(duì)心肌細(xì)胞鎂離子調(diào)節(jié)的可能性。據(jù)文獻(xiàn)記載，AT1具有激活心肌細(xì)胞增殖、促進(jìn)心肌纖維化和誘發(fā)心肌肥大等作用[7]， AT2受體主要介導(dǎo)心肌肥大時(shí)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)[8]。但是，AT1受體與TRPM7通道的關(guān)系在我們目前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中尚不明確。雖然目前已知TRPM7蛋白有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，而且TRPM7可以通過自身磷酸化來調(diào)節(jié)其功能[9]。但是，目前文獻(xiàn)中尚無AT1受體介導(dǎo)的TRPM7蛋白磷酸化的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)證明，AngⅡ可以通過心肌細(xì)胞的TRPM7通道下調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi)游離鎂離子水平。而臨床資料提示，鎂離子不足可能使心臟在高血壓、炎癥和缺血等誘因下更容易受損。我們的實(shí)驗(yàn)為臨床上應(yīng)用AngⅡ受體阻斷劑治療高血壓、心肌肥大、心律失常等疾病提供了新的思路。

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