劉仁同，魏春佩，劉素俠

（1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，山東濱州256600；2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濱州256600；3.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)系，山東濟(jì)南250100）

紫草素誘導(dǎo)人肝癌肝細(xì)胞程序性死亡及其分子機(jī)制的研究

劉仁同1，魏春佩2，劉素俠3

（1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，山東濱州256600；2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濱州256600；3.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)系，山東濟(jì)南250100）

目的探討紫草素在體內(nèi)、體外的抗肝癌活性及其可能機(jī)制。方法采用Annexin-V FITC/PI雙染法檢測(cè)3種肝癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況，LC3轉(zhuǎn)換法(LC3 Conversion）檢測(cè)細(xì)胞自噬數(shù)量，Western blot檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白和自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá)，激光共聚焦觀察線粒體自噬情況。結(jié)果紫草素對(duì)3種肝癌細(xì)胞均具有殺傷作用，且呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性，Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白以及Annexin-V FITC/PI雙染檢測(cè)結(jié)果表明，較高濃度紫草素(6～8μM）處理24 h可有效誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。Caspase廣譜抑制劑z-VAD預(yù)處理細(xì)胞可阻止紫草素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡，紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡依賴于Caspase蛋白的剪切。另一方面，較低濃度紫草素(≤2.5μM）處理肝癌細(xì)胞12 h能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬產(chǎn)生。LC3轉(zhuǎn)換檢測(cè)、GFP-LC3熒光點(diǎn)聚集和吖啶橙染色自噬泡證明了紫草素能促進(jìn)細(xì)胞自噬的產(chǎn)生；細(xì)胞自噬早期抑制劑3-MA能有效阻斷紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬；LC3周轉(zhuǎn)和p62降解則從動(dòng)態(tài)上證明了自噬潮的產(chǎn)生，激光共聚焦結(jié)果紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬有線粒體自噬的成分，說明紫草素對(duì)線粒體有損傷。結(jié)論紫草素能在體外能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬。

紫草素；人肝癌；分子機(jī)制；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞自噬

癌癥是人類健康的重大殺手，中國(guó)是肝癌的高發(fā)區(qū)。然而肝癌的治療手段并不樂觀，手術(shù)切除限制條件很多，腫瘤過大或已轉(zhuǎn)移均不能通過切除治愈。化療成為肝癌治療重要手法，但目前已批準(zhǔn)的化療藥物很少，只有索拉芬尼一種。尋找新型肝癌治療藥物意義重大。近年的研究報(bào)道表明，紫草素具有明顯的抗腫瘤活性，能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)死亡。紫草素能通過激活Caspase途徑誘導(dǎo)一系列腫瘤細(xì)胞系凋亡性細(xì)胞死亡，如惡性黑素瘤細(xì)胞A375-S2，宮頸癌細(xì)胞Hela，結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205，膀胱癌細(xì)胞T24，舌鱗癌細(xì)胞Tca-8113，慢性髓系白血病細(xì)胞K562及U937等［1-4］，紫草素的作用機(jī)制還包括在U937細(xì)胞中抑制抗細(xì)胞凋亡的BCL-2蛋白表達(dá)進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞凋亡，在Tca-8113細(xì)胞中通過失活NF-κB與BCL-2抑制細(xì)胞增殖［5-6］。此外，還有報(bào)道表明紫草素能激活K562細(xì)胞的ROSJNK途徑以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制前列腺癌PC3細(xì)胞蛋白酶體活性以及拓?fù)洚悩?gòu)酶活性而抑制腫瘤［7-8］。本論文擬解決以下幾個(gè)方面的問題，首先確認(rèn)紫草素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的能力，而后對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行了深入研究，以期確認(rèn)部分信號(hào)通路的調(diào)控過程，最后對(duì)其可能存在的其他死亡方式進(jìn)行研究，尤其Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡，即細(xì)胞自噬，并探索機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞系和菌株：人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系：BEL7402，Huh7，HepG2；人永生化肝細(xì)胞系：L02；人胚腎細(xì)胞系：HEK293T；小鼠腹水型肝癌細(xì)胞系：H22；小鼠成纖維細(xì)胞系MEF，MEF ATG7-/-（ATG7基因雙敲除）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/c小鼠購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防與控制中心，合格證號(hào)SCXK（鄂）2010-0001；細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)部分的BALB/c-nude裸鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究，合格證號(hào)UVM（蘇）2012-0035；細(xì)胞自噬實(shí)驗(yàn)部分的BALB/c-nude裸鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SSBK（湘）2010-0001。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為SPF級(jí)。

1.1.3 試劑與儀器：細(xì)胞試驗(yàn)用紫草素購(gòu)自Enzo公司，純度≥98%，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用紫草素購(gòu)自上海融禾公司，純度≥98%；PBS緩沖液、青鏈霉素雙抗、0.05%胰酶、胎牛血清（FBS）購(gòu)自Hyclone公司；DMEM培養(yǎng)基干粉、RPMI-1640培養(yǎng)基干粉購(gòu)自Gibco公司；瓶頂濾器購(gòu)自Millipo公司或Nalgen公司；細(xì)胞凍存管購(gòu)自Corning公司，DMSO購(gòu)自Sigma公司；二氧化碳購(gòu)自武漢翔云氣體廠；刻度移液管購(gòu)自天津玻璃廠；60 mm、100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，6、12、24、48、96孔細(xì)胞培養(yǎng)微孔板購(gòu)自無(wú)錫NEST公司、Corning公司；96孔酶標(biāo)板、黑色熒光酶標(biāo)板購(gòu)自Corning公司。質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；限制性內(nèi)切酶及酶切緩沖液、6×核酸電泳上樣緩沖液購(gòu)自Takara公司；T4連接酶及其緩沖液購(gòu)自Invitrogen公司；膠回收試劑盒購(gòu)自天津天根公司；轉(zhuǎn)染試劑Fugene、TUNEL試劑盒、蛋白酶抑制劑cocktail購(gòu)自羅氏公司；轉(zhuǎn)染試劑速爾是武漢敏行公司產(chǎn)品；AnnexinV-PI雙染試劑盒購(gòu)自Bipec公司；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購(gòu)自Promega公司；MitoTracker Red線粒體探針、C-400活性氧自由基探針購(gòu)自Invitrogen公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成公司。

-80℃超低溫冰箱、低溫超速離心機(jī)，Thermo；4℃/-20℃冰箱，海爾、美的；水平電泳槽、電泳電源，君意；凝膠成像系統(tǒng)，SYNGENE；紫外透射儀、微量掌上型離心機(jī)，鵬鑫；垂直電泳槽，天能；半干轉(zhuǎn)膜儀，Bio-Rad；洗片機(jī)，蘇星；滅菌鍋，TOMY；熒光倒置光學(xué)顯微鏡、熒光正置光學(xué)顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡，Olympus；透射電子顯微鏡，Hitachi；離心機(jī)，Thermo、Eppendorf。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞凍存管從液氮罐中取出，迅速置于37℃水浴鍋中，同時(shí)不斷搖動(dòng)凍存罐使受熱均勻，3min內(nèi)快速解凍。75%醫(yī)用酒精消毒凍存管表面，在生物安全柜中打開管蓋，用移液器將含細(xì)胞的凍存液輕輕吹打混勻并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，補(bǔ)充10 mL與該細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)應(yīng)的DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿置于37℃，含5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。約6h后，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞。若細(xì)胞大部分貼壁，則更換新鮮培養(yǎng)基以避免凍存液中的DMSO對(duì)細(xì)胞的傷害；若貼壁細(xì)胞不多，則繼續(xù)培養(yǎng)，至觀察到多數(shù)細(xì)胞貼壁時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞用含有10%胎牛血清（FBS）及1%青鏈霉素（P/S）的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，BEL7402、Huh7、HepG2、HEK293T、MEF細(xì)胞系的液體培養(yǎng)基選用DMEM；L02、H22細(xì)胞系的液體培養(yǎng)基選用RPMI-1640。100 mm培養(yǎng)皿中通常液體培養(yǎng)基體積為10m L。

1.2.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)：Annexin-V FITC/PI雙染法檢測(cè)：①胰酶消化細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到干凈離心管；②1 500 r/min，5min離心，棄去上清培養(yǎng)基，加入1mL PBS重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到EP管；③1500 r/min，5min離心，棄去PBS，加入約200μL PBS重懸細(xì)胞；④加入5μL異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V（AnnexinV-FITC），室溫避光染色10min；⑤加入10μL碘化丙啶（PI），轉(zhuǎn)移至流式管，檢測(cè)前4℃保存；⑥流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin-V FITC用FL1通道檢測(cè)、PI用FL2通道檢測(cè)；⑦流式軟件分析數(shù)據(jù)并作圖。

1.2.3 細(xì)胞自噬檢測(cè)：LC3轉(zhuǎn)換法（LC3 Conversion）Western blot檢測(cè)LC3-II的表達(dá)量，反映自噬體生成數(shù)量。

GFP-LC3熒光點(diǎn)聚集實(shí)驗(yàn)：自噬體形成時(shí)，自噬體膜上的腦磷脂（PE）將招募游離于胞質(zhì)的LC3-I并與之結(jié)合形成LC-II。利用這一特性，外源轉(zhuǎn)染帶GFP標(biāo)簽的LC3融合蛋白（GFPLC3），可指示LC3的轉(zhuǎn)位。BEL7402、Huh7、HepG2、HEK293T、MEF、L02、H22細(xì)胞系細(xì)胞種植于12孔板內(nèi)的細(xì)胞爬片上，適量GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h后，加入10μmol/L紫草素刺激。加1滴熒光封片液（抗熒光淬滅劑：DAPI染液=7：3）于載玻片上，細(xì)胞爬片的細(xì)胞面朝下覆蓋液滴，正置熒光顯微鏡下觀察。每個(gè)玻片計(jì)數(shù)至少100個(gè)轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，計(jì)算其中具有超過5個(gè)熒光聚集點(diǎn)的細(xì)胞的比例，指示細(xì)胞自噬的程度。

2 結(jié)果

2.1 紫草素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡

2.1.1 紫草素對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用：隨著紫草素使用濃度的升高，肝癌細(xì)胞的存活率顯著下降，并呈濃度梯度效應(yīng)。3種肝癌細(xì)胞系中，Huh7對(duì)紫草素最為敏感，8μM的紫草素處理24 h后，細(xì)胞活力僅剩20%左右，BEL7402次之，存活率約為40%，而HepG2則對(duì)紫草素相對(duì)不敏感，處理后仍有超過60%的細(xì)胞存活。經(jīng)過Excel軟件對(duì)濃度-效應(yīng)曲線進(jìn)行擬合計(jì)算，紫草素處理24 h對(duì)3種肝癌細(xì)胞系的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為：（4.0±0.4）μM（Huh7），（5.3±0.1）μM（BEL7402），（8.3± 0.3）μM（HepG2）。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)（0、4、8、12、16、24、48 h），4μM及8μM紫草素處理下的BEL7402細(xì)胞和Huh7細(xì)胞的存活率也隨之逐漸下降。綜合來(lái)看紫草素能有效殺傷肝癌細(xì)胞，且具有濃度和時(shí)間依賴效應(yīng)（見圖1）。

圖1 紫草素對(duì)肝癌細(xì)胞系殺傷作用Fig.1 Shikonin killing effect on HCC cell lines

2.1.2 紫草素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞CASPASE依賴的細(xì)胞凋亡：如圖2所示，3種肝癌細(xì)胞系BEL7402、HepG2和Huh7與溶劑DMSO處理組一起用Annexin-V FITC/PI染色，而后用流式細(xì)胞儀對(duì)處于細(xì)胞凋亡各時(shí)期的細(xì)胞進(jìn)行歸類鑒定，可以看到，隨著紫草素濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Annexin-V陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)也隨之增多。

圖2 紫草素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Fig.2 Flow cytometric detection of shikonin-induced apoptosis of hepatocellular carcinoma cells

這里將Annexin-V陽(yáng)性的細(xì)胞定義為發(fā)生凋亡的細(xì)胞，紫草素處理后的肝癌細(xì)胞均發(fā)生了細(xì)胞凋亡，且Huh7細(xì)胞系最為敏感，BEL7402次之，HepG2較不敏感。利用Western blot檢測(cè)了這些細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著紫草素濃度的升高，在4～8μM的濃度范圍，這些分子均發(fā)生了明顯的剪切（見圖3A）。紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡蛋白剪切不僅具有濃度依賴效應(yīng)，而且具有時(shí)間依賴效應(yīng)（圖3B）。由結(jié)果可知從12 h起，這些細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白就已發(fā)生剪切了。這從分子水平表明紫草素能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖3 Western blot分析檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的剪切情況Fig.3 Western blot analysis of shear the apoptosis related protein detection

為了進(jìn)一步驗(yàn)證紫草素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡是否依賴于CASPASE的剪切，利用Caspase的廣譜抑制劑Z-VAD-fmk 50μM預(yù)處理1 h后，再用6μM紫草素刺激肝癌細(xì)胞24 h，而后測(cè)量細(xì)胞存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Caspase的廣譜抑制劑Z-VAD-fmk幾乎能完全拯救紫草素對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用，這說明紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是依賴于Caspase的剪切活性而完成的（見圖4）。

圖4 Caspase廣譜抑制劑Z-VAD-fmk預(yù)處理對(duì)紫草素殺傷作用的拯救Fig.4 Save grain killing effect of caspase broad-spectrum inhibitor Z-VAD-fmk pretreatment on shikonin

2.1.3 紫草素對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)控分子的影響：利用Western blot檢測(cè)抑制外源性凋亡的c-FLIP（L）（長(zhǎng)鏈型）、抑制內(nèi)源性凋亡的BCL-2家族分子BCL-2、BCL-XL和MCL-1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫草素處理能夠下調(diào)c-FLIP（L）和BCL-2分子，然而BCL-XL分子表達(dá)量并未發(fā)生變化。令人意外的是，抑制內(nèi)源性凋亡的MCL-1分子在紫草素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后發(fā)生了上調(diào)（見圖5）。這些結(jié)果表明，抑制細(xì)胞凋亡的c-FLIP（L）和BCL-2分子在紫草素處理后的下調(diào)可能參與了紫草素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡，對(duì)MCL-1的上調(diào)還需要更深入的研究。

圖5 紫草素刺激對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)控分子的影響Fig.5 Effect of shikonin on cell apoptosis related molecules

2.2 紫草素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬

2.2.1 紫草素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的濃度、時(shí)間梯度及最佳條件：用0、1、2、3、4、5μM紫草素處理BEL7402和Huh7細(xì)胞24 h，而后用Western blot分析，如圖3所示，細(xì)胞凋亡標(biāo)志性蛋白PARP的剪切在3μM以下的紫草素刺激中并未觸發(fā)，而細(xì)胞自噬啟動(dòng)的標(biāo)志性蛋白LC3-II的表達(dá)水平在0～2μM的紫草素刺激中逐漸增強(qiáng)，2μM左右達(dá)到峰值，從3μM開始LC-II的量反而下降，而濃度高于3μM的紫草素處理細(xì)胞則導(dǎo)致PARP被剪切。這些實(shí)驗(yàn)初步說明，紫草素能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬，其標(biāo)志性蛋白LC3-II的表達(dá)量在0～5μM這個(gè)濃度范圍先增強(qiáng)后減弱，到達(dá)自噬體形成峰值后的減弱同時(shí)伴隨著細(xì)胞凋亡起始發(fā)生。

鑒于紫草素濃度太低（小于1μM）或太高（大于3μM）時(shí)，LC3-II的表達(dá)量都偏低。為研究紫草素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的最佳時(shí)間，用2μM紫草素處理肝癌細(xì)胞不同時(shí)間后，Western blot檢測(cè)LC3-II的含量，如圖6所示，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，LC3-II含量逐漸升高，12 h達(dá)到峰值，12 h過后LC3-II含量反而下降，這說明12 h的紫草素刺激時(shí)間是檢測(cè)紫草素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬的最佳時(shí)間。同時(shí)用Western blot檢測(cè)PARP和CASPASE 8的剪切情況，發(fā)現(xiàn)在2μM紫草素刺激條件下，24 h內(nèi)的任何時(shí)間點(diǎn)都沒有觀察到這些細(xì)胞凋亡蛋白發(fā)生剪切，也就是說在2μM紫草素處理12 h的細(xì)胞自噬誘導(dǎo)條件下，不會(huì)觸發(fā)細(xì)胞凋亡。

圖6 紫草素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的濃度梯度（A）和時(shí)間梯度（B）Fig.6 Concentrations of shikonin induced autophagy（A）and the time gradient（B）

2.2.2 GFP-LC3熒光點(diǎn)聚集與吖啶橙染色實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞自噬發(fā)生：如圖7A所示，閾值設(shè)定為5，經(jīng)過2.5μM紫草素處理12 h以后，擁有超過5個(gè)熒光聚集點(diǎn)的細(xì)胞比例從20%上升到80%。如圖7B所示，吖啶橙染色后，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)酸性自噬泡的細(xì)胞發(fā)出橙色熒光。紫草素處理前，幾乎沒有這樣的橙色細(xì)胞，經(jīng)過2.5μM紫草素處理12 h后，有大約30%左右肝癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)發(fā)出了橙色熒光。

圖7 GFP-LC3熒光點(diǎn)聚集（A）與吖啶橙染色（B）實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞自噬圖Fig.7 Autophagy diagram of GFP-LC3 fluorescence point aggregation and acridine orange staining experiments

2.2.3 紫草素誘導(dǎo)自噬潮發(fā)生：如圖8所示，加入CQ預(yù)處理后，LC3-II的表達(dá)量在紫草素刺激后的上升量比紫草素單獨(dú)刺激時(shí)明顯增多（過量CQ存在下，自噬體一旦生成便不能降解，故單獨(dú)CQ作用也可引起LC3-II增多，但是這種增多比CQ與細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑聯(lián)合處理要少），說明CQ對(duì)溶酶體活性的抑制，阻止了后續(xù)自噬體的降解，這也證明了紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬后期會(huì)發(fā)生自噬體降解的情況，即紫草素能指導(dǎo)自噬潮的發(fā)生。通過檢測(cè)紫草素刺激下的p62表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)隨著紫草素刺激濃度的上升，p62水平逐漸下降，說明紫草素誘導(dǎo)下，肝癌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了自噬溶酶體的降解過程。

圖8 自噬潮（autophagic flux）的驗(yàn)證Fig.8 Autophagy tide（Autophagic flux）validation

2.2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體自噬：如圖9所示，親線粒體的紅色熒光染料Mito-Tracker Red可以特異性標(biāo)記線粒體，用GFP-LC3質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染標(biāo)記自噬體，紫草素刺激后，在熒光顯微鏡下看到紅色和綠色的部分熒光重合成黃色，說明紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬有線粒體自噬的成分，紫草素對(duì)線粒體有損傷。

圖9 激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體自噬Fig.9 Observation ofmitochondrial autophagy by laser confocalmicroscopy

3 討論

本研究對(duì)紫草素的抗肝癌分子機(jī)制分為2部分進(jìn)行。前一部分為紫草素在4～8μM處理24 h的條件下誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡作為Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡方式，是靶向抗腫瘤藥物殺傷癌細(xì)胞的最常見機(jī)制［9-10］。然而Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡即細(xì)胞自噬，目前在腫瘤藥物治療研究領(lǐng)域仍有較大爭(zhēng)議，因此對(duì)紫草素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以外的抗腫瘤機(jī)制研究主要關(guān)注于其誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的能力。本研究發(fā)現(xiàn)2.5μM的紫草素刺激12 h能達(dá)到自噬體產(chǎn)生的最大峰值（以LC3-Ⅱ的表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)）。

許多研究細(xì)胞程序性死亡的學(xué)者認(rèn)為［11］，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是癌癥治療中的一把利器，但腫瘤細(xì)胞能發(fā)展許多方法如細(xì)胞自噬抵抗等逃避這把利器的殺傷［12］；細(xì)胞自噬則是腫瘤治療中的一把雙刃劍［13］。一方面，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞能在營(yíng)養(yǎng)不良、化療藥物刺激等不良環(huán)境下借助激活細(xì)胞自噬得以存活。同時(shí)細(xì)胞自噬的抑制會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡功能缺失的腫瘤細(xì)胞基因組不穩(wěn)定、活性氧自由基的積累以及細(xì)胞壞死，說明細(xì)胞自噬對(duì)癌細(xì)胞生存有利。另一方面，許多抗癌分子，如雷帕霉素，能激活腫瘤細(xì)胞自噬性死亡從而將其清除出機(jī)體［14］，雖然雷帕霉素因?yàn)槠涓叨拘晕茨艹蔀榭鼓[瘤臨床藥物，但激活腫瘤細(xì)胞自噬也被認(rèn)為是癌癥治療的有效靶點(diǎn)［15］。本研究中，紫草素在體內(nèi)體外均能激活肝癌細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬，但誘導(dǎo)這2種死亡方式的作用濃度和時(shí)間明顯不同。綜合本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以認(rèn)為紫草素初具這種“多”特性的化療藥物的潛能。雖然紫草素的直接親和攻擊靶點(diǎn)未知，而且可能也是多靶點(diǎn)的，但其能作用于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的多條重要的細(xì)胞信號(hào)通路，改變多個(gè)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，激活多種主要的細(xì)胞編程性死亡過程，都說明紫草素具有潛在的臨床藥用價(jià)值。

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（編校：吳茜）

Studies on molecular mechanisms of shikonin-induced programmed cell death in human hepatocellular carcinoma cells

LIU Ren-tong1，WEIChun-pei2，LIU Su-xia3

（1.Department of Hematology，Affiliated Hospital of Binzhou Medical College，Binzhou 256600，China；2.Department of Inspection，Affiliated Hospital of Binzhou Medical College，Binzhou 256600，China；3.Department of Medicine，Shandong University，Jinan 250100，China）

ObjectiveTo study the activity of shikonin on anti-hepatoma in vitro and in vivo and its possiblemechanism.MethodsCell apoptosis was detected by Annexin-V FITC/PI double staining assay；aggregation test was detected by LC3 conversion method in autophagy，Western blot and GFP-LC3 fluorescence point.ResultsHepatoma cells and normal liver cellswere induced autophagy by shikonin（less than or equal to 2.5μM）for 12 hours.LC3 conversion，GFP-LC3 fluorescence detection point aggregation and acridine orange staining autophagic vacuoles proved that shikonin induced autophagy.Shikonin induced autophagy could be blocked by early 3-MA autophagy inhibitors effectively；the generation of autophagy tideswas proved by LC3 turnover and p62 degradation.Resultsof apoptosis protein markers detected by Western blot and Annexin-V FITC/PI showed that the higher concentration of shikonin（6～8μM）for 24 hours treatment could induce apoptosis of hepatocellular carcinoma，but couldn't affect the survival of deteriorated liver cells.Apoptosis of hepatocellular carcinoma was prevented by pretreated with broad-spectrum inhibitor z-VAD of Caspase cells.Shikonin induced cell apoptosis depended on the shear of Caspase protein.ConclusionShikonin could induce the apoptosis and autophagy of hepatocellular carcinoma cells in vitro.

shikonin；human hepatocellular carcinoma；molecularmechanisms；apoptosis；autophagy

R966

A

1005-1678(2014）07-0001-05

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2009HD009）

劉仁同，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：血液惡性腫瘤研究及治療，E-mail：ltr1821460122@163.com。