孫承浩，王吉華

（1.遼陽(yáng)市中心醫(yī)院，遼寧遼陽(yáng)111000；2.遼陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧遼陽(yáng)111000）

HPLC 同時(shí)分析芎菊上清丸中7個(gè)化學(xué)成分的含量研究

孫承浩1，王吉華2

（1.遼陽(yáng)市中心醫(yī)院，遼寧遼陽(yáng)111000；2.遼陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧遼陽(yáng)111000）

目的建立HPLC同時(shí)測(cè)定芎菊上清丸中7個(gè)活性成分(梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿）含量的方法。方法采用PorosheLL 120 SB-C18(100mm×3.0mm，2.7μm）色譜柱，柱溫30℃，以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm 0～4.5min(測(cè)定梔子苷），348 nm 4.5～9.0 min(測(cè)定連翹酯苷A、綠原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸），278 nm 9.0～15.0min(測(cè)定鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿）。結(jié)果梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿的線性范圍分別為4.024～80.48μg/mL(r= 0.9991），2.042～40.84μg/mL(r=0.9993），3.956～79.12μg/mL(r=0.9996），6.090～121.80μg/mL(r=0.9990），4.026～80.52μg/ mL(r=0.9995），3.924～78.48μg/mL(r=0.9998），6.030～120.6μg/mL(r=0.9998）。平均加樣回收率(n=6）分別為96.5%，97.5%，95.9%，98.6%，99.8%，98.4%和97.3%；RSD分別為1.5%，1.3%，1.2%，1.4%，1.2%，1.1%和0.9%。結(jié)論該方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，為評(píng)價(jià)和監(jiān)控芎菊上清丸的質(zhì)量提供了可靠的方法。

芎菊上清丸；HPLC；含量測(cè)定

芎菊上清丸收載于《中國(guó)藥典》（2010版）一部，由川芎、菊花、黃芩、連翹、黃連等15味中藥材組成，具有清熱解表、散風(fēng)止痛之功效，用于外感風(fēng)邪引起的惡風(fēng)身熱、偏正頭痛、鼻流清涕、牙疼喉痛［1］，含量測(cè)定項(xiàng)為薄層色譜掃描法測(cè)定黃連中鹽酸小檗堿的含量。藥典規(guī)定的含量測(cè)定方法基本上是在開(kāi)放體系中進(jìn)行，因此影響定量結(jié)果的因素較復(fù)雜，準(zhǔn)確性差。另?yè)?jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道［2-5］，可見(jiàn)對(duì)芎菊上清丸中黃芩苷、綠原酸進(jìn)行含量測(cè)定的研究，未見(jiàn)同時(shí)測(cè)定處方中多組分含量的研究報(bào)道。為了更好的評(píng)價(jià)和監(jiān)督芎菊上清丸的質(zhì)量，本文采用RP-HPLC梯度洗脫法在同一色譜條件下變換檢測(cè)波長(zhǎng)同時(shí)分析處方中5味藥材的7個(gè)特征性成分的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent 1260高效液相色譜儀系統(tǒng)，由G1311A四元泵、G1314B可變波長(zhǎng)檢測(cè)器（VWD）、G1322A在線脫氣機(jī)組成。

對(duì)照品梔子苷（批號(hào)為110749-201316）、連翹酯苷A（批號(hào)為111810-201103）、綠原酸（批號(hào)為110753-201314）、3，5-O-二咖啡?；鼘幩幔ㄅ?hào)為111782-201204）、黃芩苷（批號(hào)為110715-201117）、鹽酸藥根堿（批號(hào)為110733-201108）、鹽酸小檗堿（批號(hào)為110713-201212）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。供試品芎菊上清丸為北京同仁堂制藥有限公司提供，批號(hào)為2083068，2083079，3082187。

甲醇、乙腈均為色譜純，水為重蒸水，其他所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備：混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液：取梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿等對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL分別含上述相應(yīng)物質(zhì)0.2012 mg、0.1021 mg、0.1978 mg、0.3045 mg、0.2013 mg、0.1962mg、0.3015mg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

混合對(duì)照品溶液：精密移取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液5.0mL于50mL容量瓶中，用60%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制得混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取芎菊上清丸10丸，稱(chēng)定重量，剪碎，混勻，研細(xì)，取3.0g，精密稱(chēng)定，精密加入60%甲醇水溶液50mL，稱(chēng)定重量，超聲處理（250 w，50 kHz）30min，放冷，稱(chēng)重，用60%甲醇水溶液補(bǔ)足減失的重量，離心，取上清液，即得。

陰性樣品溶液：按芎菊上清丸的處方比例和工藝方法分別制備不含梔子、連翹、菊花、黃芩和黃連的5種陰性樣品，并按“1.2.1”項(xiàng)下供試品溶液方法制備陰性溶液。

1.2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：色譜柱：安捷倫Poroshell 120 SB-C18（100mm×3.0 mm，2.7μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，8%A；5～10 min，8%A→20%A；10～15min，20%A→40%A）；流速：1.0mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm 0～4.5 min（測(cè)定梔子苷），348 nm 4.5～9.0min（測(cè)定連翹酯苷A、綠原酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩幔?，278 nm 9.0～15.0min（測(cè)定鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿）；進(jìn)樣量：5μL。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿計(jì)算應(yīng)不低于5000，各峰的分離度均大于1.5。

1.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批號(hào)芎菊上清丸樣品（批號(hào)2083068），稱(chēng)定重量，研細(xì)，取約3.0g，共6份，精密稱(chēng)定，分別按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣5μL。

1.2.4 回收率試驗(yàn)：取已知含量的芎菊上清丸樣品（梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩帷Ⅺ}酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿的含量分別為1.485，0.784，1.012，1.544，1.069，3.969，1.221mg/g）粉末6份，每份1.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，分別加入新配置的混合對(duì)照品溶液（各對(duì)照品濃度為：梔子苷0.2024 mg/mL、連翹酯苷A 0.1154 mg/mL、綠原酸0.1520mg/mL、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸0.2187mg/mL、鹽酸藥根堿0.1616mg/mL、黃芩苷0.6033 mg/mL、鹽酸小檗堿0.1979 mg/mL）10mL，再精密加入60%甲醇水溶液40mL，按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣5μL，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.1.1 干擾性試驗(yàn)：在上述色譜條件下，供試品中其他成分對(duì)梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿的測(cè)定無(wú)干擾（見(jiàn)圖1）。

圖1 HPLC色譜圖A.混合對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.梔子陰性溶液；D.連翹陰性溶液；E.菊花陰性溶液；F.黃芩陰性溶液；G.黃連陰性溶液吸收峰：1.梔子苷；2.連翹酯苷A；3.綠原酸；4.3，5-O-二咖啡?；鼘幩幔?.鹽酸藥根堿；6.黃芩苷；7.鹽酸小檗堿Fig.1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substances solution；B.sample solution；C-Fructus Gardeniae nagtive solvent；D.Forsythiae Fructus nagtive solvent；E.Flos Chrysanthemi nagtive solvent；F.Radix Scutellariae nagtive solvent；G.Rhizoma Coptidis nagtive solvent；1.Jasminoidin；2.Forsythoside A；3.Caffeotannic acid；4.3，5-Di-O-caffeoylquinic acid；5.Jatrorrhizine hydrochloride；6.Baicalin；7.Berberine hydrochloride

2.1.2 線性關(guān)系考察：分別精密移取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1.0，2.0，5.0，10.0，15.0，20.0mL于50mL容量瓶中，用60%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制得混合對(duì)照品系列濃度溶液，依次精密吸取上述混合對(duì)照品系列濃度溶液按“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以樣品濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿的線性關(guān)系詳見(jiàn)表1。

表1 7個(gè)成分的線性關(guān)系Tab.1 Reasults of linear equations of 7 components

2.1.3 精密度試驗(yàn)：精密吸取同一混合對(duì)照品溶液5μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.6%，0.5%，1.0%，0.4%，0.7%，0.4%，0.6%。表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，在0，2，4，8，12，24 h分別進(jìn)樣5μL，結(jié)果梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸、鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.8%，1.2%，1.8%，1.6%，0.6%，0.7%，0.5%。表明供試品溶液中的7個(gè)待測(cè)成分在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)：樣品中的梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸、鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿含量平均值分別為1.485，0.784，1.012，1.544，1.069，3.969，1.221 mg/g；RSD分別為1.5%，0.9%，0.9%，1.2%，1.1%，1.3%，1.0%，表明其重復(fù)性良好。

2.1.6 回收率試驗(yàn)結(jié)果梔子苷、連翹酯苷A、綠原酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿的平均回收率（n=6）分別為96.5%，97.5%，95.9%，98.6%，99.8%，98.4%和97.3%；RSD分別為1.5%，1.3%，1.2%，1.4%，1.2%，1.1%和0.9%。

2.2 樣品測(cè)定 取3種批號(hào)的芎菊上清丸，分別按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣5 μL，每批次樣品取樣2份，并進(jìn)行2次平行測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，平均值結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 芎菊上清丸中7個(gè)活性成分的含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）Tab.1 The contents of seven active ingredients in Xiongju Shangqing pills（mg/g）

3 討論

3.1 提取條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別采用超聲提取、加熱回流方法對(duì)芎菊上清丸中7個(gè)成分的提取效率進(jìn)行考察，結(jié)果表明采用超聲提取法提取時(shí)效率更高，且相對(duì)簡(jiǎn)便易行；提取溶劑考察水、60%甲醇溶液、甲醇、乙酸乙酯等，結(jié)果表明，60%甲醇溶液與甲醇對(duì)7個(gè)成分綜合提取效率最高，二者相當(dāng)，考慮到溶劑成本，采用60%甲醇溶液作提取溶劑；同時(shí)對(duì)60%甲醇溶液的用量（25、50、100mL）以及超聲時(shí)間（15、30、45min）進(jìn)行考察，最終確定提取條件為采用60%甲醇水溶液50 mL超聲處理30min。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取混合對(duì)照品溶液，采用DAD檢測(cè)器，按上述色譜條件在200～400 nm范圍內(nèi)光譜掃描，兼顧7個(gè)成分的紫外最大吸收波長(zhǎng)，最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm 0～4.5min（測(cè)定梔子苷），348 nm 4.5～9.0min（測(cè)定連翹酯苷A、綠原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸），278 nm 9.0～15.0min（測(cè)定鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿）。

3.3 流動(dòng)相的確定 由于待測(cè)組分多，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC梯度洗脫結(jié)合可變波長(zhǎng)進(jìn)行含量測(cè)定，分別考察3種溶劑系統(tǒng)：甲醇-水、乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸水溶液，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相的峰型較好，分離效果較理想。參照相關(guān)文獻(xiàn)的液相洗脫條件［4-7］，最終確定梯度洗脫條件。在15min內(nèi)完成對(duì)芎菊上清丸中7個(gè)活性成分的同時(shí)分析測(cè)定，大大縮短了分析時(shí)間。

3.4 測(cè)定成分的選擇 芎菊上清丸現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《中國(guó)藥典》2010年版一部，含量測(cè)定方法為薄層色譜掃描法檢測(cè)黃連中鹽酸小檗堿含量。芎菊上清丸由菊花、黃芩、連翹、黃連等15味中藥材制成，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)不能檢測(cè)出多種藥材的有效成分，且該方法基本上是在開(kāi)放體系中進(jìn)行，因此影響定量結(jié)果的因素較復(fù)雜，準(zhǔn)確性和重復(fù)性差，影響藥品質(zhì)量的評(píng)價(jià)，不能有效的對(duì)藥品質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。本文同時(shí)測(cè)定處方中5味主要中藥材的7個(gè)有效活性成分，并進(jìn)行定量分析，可以整體反映芎菊上清丸產(chǎn)品質(zhì)量，并節(jié)約提取溶劑及縮短分析時(shí)間。

本文采用RP-HPLC梯度洗脫法在同一色譜條件下變換檢測(cè)波長(zhǎng)同時(shí)對(duì)處方中5味藥材的7個(gè)特征性成分（梔子苷、連翹酯苷A［6-7］、綠原酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩幔?-9］、鹽酸藥根堿［10-11］、黃芩苷［12］、鹽酸小檗堿［13-14］）進(jìn)行含量測(cè)定，具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快捷的特點(diǎn)，簡(jiǎn)化了多次制備供試品溶液及流動(dòng)相的繁瑣步驟，節(jié)約分析時(shí)間。采用該方法可有效的控制芎菊上清丸的質(zhì)量，為芎菊上清丸質(zhì)量監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì)，中國(guó)藥典2010年版一部：675.

［2］馮波，施春玲，郝乘儀，等.RP-HPLC法測(cè)定芎菊上清丸中黃芩苷［J］.中草藥，2009，40(5）：743.

［3］王強(qiáng)，郝乘儀，馮波.RP-HPLC法測(cè)定芎菊上清丸中綠原酸的含量［J］.吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，30(4）：187.

［4］王永偉，趙萬(wàn)順，宋新波，等.芎菊上清丸質(zhì)量控制的研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11(5）：178.

［5］ 郜鳳香，梁艷.高效液相色譜法測(cè)定芎菊上清丸中梔子苷含量［J］.中國(guó)藥業(yè)，2012，21(23）：14.

［6］ 齊翠翠，李競(jìng)，高英，等.太行山區(qū)不同產(chǎn)地連翹中連翹苷、連翹醋苷A的含量測(cè)定［J］.北方藥學(xué)，2014，11(1）：1.

［7］ 佟若菲，張囡，林宏.HPLC法測(cè)定病毒合劑中黃芩苷、綠原酸和連翹酯苷A［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2014，29(3）：259.

［8］ 王英鋒，謝亮亮，劉鎖蘭，等.HPLC法測(cè)定杏香兔耳風(fēng)中綠原酸和3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬暮浚跩］.藥物分析雜志，2009，29 (3）：430.

［9］ 茅純，鄭娟，鄒耀華，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定桑菊感冒片中綠原酸、木犀草苷和3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷浚跩］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32(1）：193.

［10］陳芳，鄧雁如，許妍妍，等.雙波長(zhǎng)HPLC同時(shí)測(cè)定黃連及金芪降糖片中6種生物堿的含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19 (17）：60.

［11］施法，白旭東，董斌，等.HPLC法同時(shí)分析測(cè)定明目上清片中10個(gè)化學(xué)成分［J］.藥物分析雜志，2014，34(1）：91.

［12］牟英迪，林吉茂.HPLC程序波長(zhǎng)法測(cè)定牛黃上清丸中黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿［J］.中成藥，2013，35(9）：1933.

［13］匡艷輝，朱晶晶，王智民，等.一測(cè)多評(píng)法測(cè)定黃連中小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿含量［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2009，44 (5）：390.

［14］郝乘儀，郭淑英，馮波，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定芎菊上清丸中綠原酸、鹽酸小檗堿和黃芩苷的含量［J］.藥物分析雜志，2014，34 (1）：193.

（編校：吳茜）

Simultaneous determ ination of seven active ingredients in Xiongju Shangqing pills by HPLC

SUN Cheng-hao1，WANG Ji-hua2

（1.Liaoyang Central Hospital，Liaoyang 111000，China；2.Liaoyang Institute for Food and Drug Control，Liaoyang 111000，China）

ObjectiveTo establish amethod for simultaneous determination of seven active ingredients（Jasminoidin，F(xiàn)orsythoside A，Caffeotannic acid，3，5-Di-O-caffeoylquinic acid，Jatrorrhizine Hydrochloride，Baicalin，Berberine Hydrochloride）.MethodsThe determination was carried outwith Agilent Poroshell120 SB-C18（100mm×3.0mm，2.7μm）；The mobile phase consisted of acetonitrile（A）-0.1%phosphoric acid solution（B）with gradient elution at a flow rate of 1.0mL/min；The detection wavelengthswere 230 nm in 0～4.5min（determination of Jasminoidin），348 nm in 4.5～9.0min（determination of Forsythoside A，Caffeotannic acid，3，5-Di-O-caffeoylquinic acid），and 278 nm in 9.0～15.0 min（determination of Jatrorrhizine Hydrochloride；Baicalin；Berberine Hydrochloride）.ResultsThe calibration curveswere linear in the ranges of4.024～80.48μg/mL for Jasminoidin（r=0.9991），2.042～40.84μg/mL for Forsythoside A（r=0.9993），3.956～79.12μg/mL for Caffeotannic acid（r=0.9996），6.090～121.80μg/mL for 3，5-Di-O-caffeoylquinic acid（r=0.9990），4.026～80.52μg/mL for Jatrorrhizine Hydrochloride（r=0.9995），3.924～78.48μg/ mL for Baicalin（r=0.9998），6.030～120.6μg/mL for Berberine Hydrochloride（r=0.9998）.The average recoveries（n=6）were 96.5%，97.5%，95.9%，98.6%，99.8%，98.4%and 97.3%；RSDs were 1.5%，1.3%，1.2%，1.4%，1.2%，1.1%and 0.9%respectively.ConclusionThe method is simple and repeatable，which can be applied to the quality control of Xiongju Shangqing pills.

Xiongjushangqing pills；HPLC；content determination

R917

A

1005-1678(2014）07-0177-04

遼寧省教育廳高等學(xué)校科研計(jì)劃（20100352）

孫承浩，男，本科，副主任藥師，研究方向：臨床藥學(xué)，E-mail：sunchenghao_s@163.com。