華紅偉 姜 峰 胡薇薇 李 靜 丁 罡

分泌性富含半胱氨酸的酸性蛋白(secreted protien acidic and rich in cysteine,SPARC)是細(xì)胞外基質(zhì)非膠原糖蛋白中的1種鈣結(jié)合蛋白，也稱骨連接蛋白(osteonectin)[1]。SPARC基因定位于人類染色體5q31.3-q32[2]，編碼由298-304個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。SPARC蛋白參與多種生物學(xué)過程，包括胚胎發(fā)育，成骨組織形成，傷口愈合及組織重建等[3]；同時(shí)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)，主要涉及新生血管的形成[4]，調(diào)控細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附作用[5]等過程，但SPARC與腫瘤細(xì)胞糖酵解之間的調(diào)節(jié)關(guān)系及作用機(jī)制目前尚未見報(bào)道。

糖酵解作用中己糖激酶(hexokinase 2,HK)是第一個限速酶，當(dāng)細(xì)胞中HK活力增強(qiáng)時(shí)，6-磷酸葡萄糖增加，為糖酵解提供充足的碳源和能源[6]；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase-A,LDHA)是糖酵解途徑的末端酶，催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，LDHA在多種腫瘤中高表達(dá)，提示LDHA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。本研究以肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B、Huh7為研究對象，觀察SPARC表達(dá)與HK-Ⅱ及LDHA活性之間的相互作用關(guān)系，初步探究SPARC與糖酵解作用之間的相互關(guān)系及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)選取HepG2、Hep3B、Huh7人肝癌細(xì)胞作為研究對象，購自于美國菌種保藏中心細(xì)胞庫(ATCC)。細(xì)胞株培養(yǎng)于含5%二氧化碳、溫度為37.5 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，所用DMEM培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清及青-鏈霉素雙抗(penicillin-streptomycin,PS)。

1.2 主要試劑及耗材

SPARC質(zhì)粒及siRNA購自于北京傲銳東源生物科技有限公司；Oligofectamine、pti-MEM?I 低血清培養(yǎng)基購自于Invitrogene 公司；乳酸脫氫酶活性檢測試劑盒購自于BioVision公司；己糖激酶比色檢測試劑盒購自于Sigma公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 質(zhì)粒/siRNA的轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前一天取出對數(shù)生長期的細(xì)胞，以每孔3-5×105密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，當(dāng)細(xì)胞融合率在70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；將濃度梯度為2 μg/ml，4 μg/ml，6 μg/ml的質(zhì)粒分別加入Opti-MEM I低血清培養(yǎng)基，共100 μl輕輕搖勻；以O(shè)ligofectamine作為轉(zhuǎn)染載體，按照質(zhì)粒(μg)：Oligofectamine(μl)=1∶2的比例加入Oligofectamine，用Opti-MEM I 低血清培養(yǎng)基稀釋，總體積為100 μl，在室溫下孵育5 min；將上述兩種混合物混合(共200 μl)，室溫下孵育30 min，直到質(zhì)粒：Oligofectamine復(fù)合物形成；將復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃、CO2培養(yǎng)箱孵育8 h。24 h后換液，再過24 h收集細(xì)胞評估轉(zhuǎn)染效率，并篩選出最佳質(zhì)粒濃度。

1.3.2 比色法檢測HK/LDHA活性 檢測前一天，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以2×105/孔密度接種于24孔板中；棄去原培養(yǎng)液，PBS漂洗細(xì)胞2次，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400 r/min離心5 min,吸去上清液；加入用PBS稀釋10倍后的試劑盒提供的HK/LDHA釋放試劑150 μl,適當(dāng)搖晃混勻，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h；應(yīng)用己糖激酶檢測試劑盒/乳酸脫氫酶檢測試劑盒，按照說明書方法通過一系列HK/LDHA標(biāo)準(zhǔn)品及相應(yīng)測得的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用酶標(biāo)儀分別在563 nm及490 nm處檢測吸光度(OD值)，間接反映HK,LDHA活性的變化。每個樣品重復(fù)測定3次。

2 結(jié)果

轉(zhuǎn)染SPARC質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞中HK的活性與對照組相比明顯下降，HepG2/Hep3B/Huh7 3種肝癌細(xì)胞中HK-Ⅱ的相對吸光度分別降低至(57.45±5.05)%、(56.1±5.70)%、(49.73±7.06)%，P<0.05)；反之，siRNA抑制SPARC表達(dá)后的細(xì)胞中，3種細(xì)胞中HK-Ⅱ的相對吸光度分別上調(diào)至(174.20±8.41)%、(166.69±9.71)%、(152.84±3.39)%，有顯著性差異(P<0.05)(圖1，表1)。

轉(zhuǎn)染SPARC質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞中LDHA的活性與對照組相比明顯下降，HepG2/Hep3B/Huh7 3種肝癌細(xì)胞中LDHA的相對吸光度分別降低至(50.53±8.07)%、(54.38±2.08)%、(42.34±3.44)%；反之，siRNA抑制SPARC表達(dá)后的HepG2細(xì)胞中，LDHA的活性較對照組明顯上調(diào)，3種肝癌細(xì)胞中LDHA的相對吸光度分別上調(diào)至(176.65±6.85)%、(163.24±6.44)%、(151.25±6.75)%，有顯著性差異(P<0.05)(圖2，表2)。

3 討論

SPARC具有多種生物學(xué)功能，在多種腫瘤中，如乳腺癌[7]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[8]、黑色素瘤[9]中均表現(xiàn)為高表達(dá)，它與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等病理過程密切相關(guān)[10]，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及對腫瘤信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)功能較復(fù)雜，并且具有組織特異性，目前的研究主要集中于SPARC對腫瘤新生血管形成、EMT轉(zhuǎn)變、相關(guān)生長因子及受體表達(dá)、以及蛋白水解酶表達(dá)等調(diào)節(jié)作用方面[11]。糖酵解代謝是惡性腫瘤細(xì)胞獲取能量的主要來源，腫瘤細(xì)胞糖酵解活躍程度與腫瘤生長速度和侵襲性有密切關(guān)切，但SPARC與糖酵解作用的相互關(guān)系研究較少。

本研究以肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B、Huh7為研究對象，分別轉(zhuǎn)染SPARC與siRNA SPARC，以促進(jìn)SPARC高表達(dá)或抑制SPARC基因的表達(dá)，應(yīng)用比色法檢測在SPARC不同表達(dá)水平時(shí)，糖酵解關(guān)鍵酶HK-Ⅱ與LDHA的活性變化，觀察SPARC與這兩種糖酵解關(guān)鍵酶活性之間的相互關(guān)系，初步探究了腫瘤細(xì)胞中SPARC表達(dá)與糖酵解作用是否關(guān)聯(lián)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SPARC過表達(dá)的細(xì)胞中，HK-Ⅱ、LDHA的活性明顯下調(diào)，而當(dāng)應(yīng)用siRNA抑制SPARC表達(dá)時(shí)，HK-Ⅱ、LDHA的活性明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示肝細(xì)胞癌中，SPARC的表達(dá)水平與細(xì)胞糖酵解作用相互關(guān)聯(lián)，SPARC通過負(fù)性調(diào)控糖酵解作用的關(guān)鍵酶HK-Ⅱ、LDHA參與介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的糖酵解作用，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而Le Bail 等的報(bào)道顯示SPARC在肝細(xì)胞癌的基質(zhì)中呈高表達(dá)水平，并與肝癌的惡性程度有關(guān)[12]，陳科濟(jì)等[13]利用RT-PCR技術(shù)分別檢測 62 例HCC及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本、30例正常肝組織標(biāo)本中 SPARC mRNA 的表達(dá)，結(jié)果顯示SPARC 在HCC癌組織中表達(dá)上調(diào)，在正常肝組織中低表達(dá)，因此SPARC在腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出促癌或抑癌作用還有待進(jìn)一步明確，同時(shí)相關(guān)生物學(xué)作用是否與肝癌細(xì)胞的類型、不同腫瘤的病理類型、腫瘤分期相關(guān)尚未清晰。同時(shí)，目前另有研究表明，SPARC與AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protiein kinase,AMPK)信號傳導(dǎo)通過具有相互調(diào)節(jié)作用，AMPK作為能量代謝變化的感受器，能夠被ATP/AMP的比值變化所激活，SPARC通過AMPK信號通路參與調(diào)控細(xì)胞的糖酵解過程[14]，因此，結(jié)合本研究結(jié)果，SPARC、糖酵解關(guān)鍵酶及AMPK信號通路之間是否存在相互調(diào)節(jié)作用還有待深入探究。

圖1 HepG2/Hep3B/Huh7細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染SPARC或siRNA SPARC后HK相對活性的變化

表1 HepG2/Hep3B/Huh7細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染SPARC或siRNA SPARC后HK在563 nm處的OD值，(X±SEM，%)

*為與對照組比較，P<0.05。

圖2 HepG2/Hep3B/Huh7細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染SPARC或siRNA SPARC后LDHA的相對活性

表2 HepG2/Hep3B/Huh7細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染SPARC或siRNA SPARC后LDHA在490 nm處的OD值(X±SEM，%)

*為與對照組比較，P<0.05。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌中SPARC通過負(fù)性調(diào)節(jié)糖酵解關(guān)鍵酶影響細(xì)胞的糖酵解過程，在下一步研究中，我們將在不同類型的肝癌細(xì)胞系及肝癌組織樣本中，進(jìn)一步探究SPARC表達(dá)與糖酵解的作用機(jī)制，為抑制肝細(xì)胞癌的發(fā)展機(jī)制研究提供了新的思路。

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