閻 良 吳雪卿 黃建平 龐惠芳

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來乳腺癌的發(fā)病率有明顯的增高?；瘜W(xué)藥物治療作為乳腺癌術(shù)前或術(shù)后輔助治療得到了廣泛的應(yīng)用，腫瘤體積大的乳腺癌術(shù)前短期化療可使腫瘤體積縮小，有利于手術(shù)切除，但對術(shù)后長期的化療以及無法手術(shù)患者姑息性化療的意義有不同的意見。近年來的研究發(fā)現(xiàn)化療藥物誘發(fā)的腫瘤細(xì)胞多藥耐藥(MDR)和侵襲轉(zhuǎn)移之間可能存在某種關(guān)聯(lián)，乳腺癌細(xì)胞在MDR藥物作用下不但P-gp和EMMPRIN(CD147)表達(dá)增強(qiáng)，還可能出現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，這種轉(zhuǎn)化有利于腫瘤細(xì)胞逃避化療藥物的攻擊，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[1]。但EMT的發(fā)生與mdr基因活化的關(guān)系尚不清楚。本課題通過比較不耐藥乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)、相應(yīng)的用化學(xué)藥物誘導(dǎo)的乳腺癌耐藥細(xì)胞株(MCF-7/Adr)和多耐藥基因1(multidrug resistance gene1，mdr1)導(dǎo)入建立的乳腺癌耐藥細(xì)胞株(MCF-7/MDR1)中P-gp、CD147和E-cadherin(E-cd)的表達(dá)，以探討MDR基因與CD147表達(dá)以及腫瘤細(xì)胞EMT的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

不耐藥乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)和相應(yīng)的用化學(xué)藥物誘導(dǎo)的乳腺癌耐藥細(xì)胞株(MCF-7/Adr)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，mdr1導(dǎo)入建立的乳腺癌耐藥細(xì)胞株(MCF-7/MDR1)由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系惠贈。細(xì)胞用RPMI 1640 (gibco BRL，karlsruhe，germany)培養(yǎng)液培養(yǎng)(Thermo培養(yǎng)箱和超凈工作臺)，培養(yǎng)液中含有10%小牛血清、100 U/mL盤尼西林及100 μg/mL鏈霉素，37℃、5%CO2的溫箱中培養(yǎng)。每隔48 h換培養(yǎng)液。用0.25%的胰蛋白酶消化，收集并傳代。實(shí)驗(yàn)選用對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.2 Western blot方法

收集細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS清洗，置細(xì)胞裂解液(50 mM pH 8.0 Tris-HCl，150 mM NaCl，1%NP-40，0.1%SDS，0.5% NaN3，2 mM EDTA，25×蛋白酶抑制劑)，冰浴30 min，4℃離心(12，000 r/min，10 min)收集上清，按照BCA Protein Assay Kit定量。不連續(xù)(8%分離膠和5%的濃縮膠)垂直SDS-PAGE電泳儀(Bio-Rad)電泳，每孔上樣蛋白50 μg，電泳完成后，蛋白條帶經(jīng)濕式轉(zhuǎn)移儀(Bio-Rad)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。經(jīng)3%脫脂奶粉封閉，用鼠抗抗人P-gp (Chemicon公司)、兔抗人E-cadherin (Santa Cruz公司)、鼠抗人CD147(Santa Cruz公司)和β-actin抗體(Sigma公司)37℃孵育1 h，4℃過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(Amersham Pharmacia Biotech)37℃孵育30 min，化學(xué)發(fā)光法顯示條帶(ECL kit，amersham pharmacia biotech)。

2 結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示三株細(xì)胞中P-gp、CD147和E-cd存在差異表達(dá)。由圖1可見，P-gp在不耐藥細(xì)胞中表達(dá)很弱，而在兩株耐藥細(xì)胞中均呈高表達(dá)。CD147在不耐藥細(xì)胞和導(dǎo)入mdr1基因細(xì)胞中的表達(dá)相近，在藥物誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，而且其條帶的位置偏下，提示其分子量較小。而E-cd在不耐藥細(xì)胞和導(dǎo)入mdr1基因細(xì)胞中均有表達(dá)，在后者中表達(dá)更為明顯，但在藥物誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞中無表達(dá)。

圖1 Western blot 檢測結(jié)果

3 討論

P-gp是mdr1編碼的跨膜糖蛋白，人類的mdr1基因位于第7號染色體上，全長約330 kb，轉(zhuǎn)錄41～45 kb的高度同源的RNA，翻譯的氨基酸殘基分子量約為140 kD，其翻譯后修飾加上去的糖鏈約為30 kD，兩者總分子量為170 kD，即為P-gp。P-gp可以利用它的疏水位點(diǎn)與疏水性抗腫瘤藥物結(jié)合，通過ATP水解供能，逆濃度梯度將藥物泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低而產(chǎn)生耐藥[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P-gp在2株耐藥細(xì)胞中高表達(dá)，不耐藥細(xì)胞中表達(dá)很弱，提示敏感乳腺癌細(xì)胞株MCF-7經(jīng)阿霉素誘導(dǎo)或mdr1基因轉(zhuǎn)染均可表達(dá)P-gp，從而產(chǎn)生耐藥性。

CD147為分子量50 000～60 000的跨膜糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員[3]，已被證實(shí)為廣泛存在于腫瘤細(xì)胞中[4-7]。在本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在mdr1基因?qū)氲哪退幖?xì)胞與藥物誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞CD147的表達(dá)不同，前者與不耐藥細(xì)胞的表達(dá)相似，而在藥物誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，提示mdr1基因?qū)胍鸬腜-gp表達(dá)增多本身并不能直接影響CD147的表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道CD147轉(zhuǎn)染能增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞株MMPs的表達(dá)，加速在裸鼠內(nèi)的成瘤性，并促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[8]。也有報(bào)道CD147還能影響乳腺癌細(xì)胞mdr1基因轉(zhuǎn)錄和P-gp表白的表達(dá)[9]。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)藥物誘導(dǎo)的而藥細(xì)胞株中CD147不但表達(dá)增強(qiáng)，而且其條帶的位置偏下，提示其分子量較小，這可能與其糖化程度有關(guān)，而一般認(rèn)為CD147分子的糖化對促進(jìn)MMPs表達(dá)等作用的體現(xiàn)是必需的[10]。這種表達(dá)量和糖化水平的不同是否可能與藥物誘導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)入引起的耐藥細(xì)胞株許多不同的生物學(xué)表現(xiàn)有關(guān)尚有待深入研究。

上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成具有活動能力、能夠在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動的間質(zhì)細(xì)胞的過程[11]。EMT是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，在腫瘤細(xì)胞侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道高劑量的阿霉素可能誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞發(fā)生EMT，表現(xiàn)為E-cd、CK19表達(dá)降低，α-SMA、vimentin表達(dá)升高，同時(shí)癌細(xì)胞的耐藥性和體外侵襲力也得以增強(qiáng)[1]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不耐藥細(xì)胞和導(dǎo)入mdr1基因細(xì)胞中E-cd均有表達(dá)，但在藥物誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞中E-cd陰性，這顯示基因?qū)肱c藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥的差異性，即藥物誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞株可能具有更為明顯的EMT傾向，這也可以解釋MCF-7/Adr乳腺癌細(xì)胞為什么比MCF7和MCF7/MDR1具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。這種差異顯然也并不是mdr1基因或P-gp蛋白表達(dá)增高的直接結(jié)果，進(jìn)一步探討其內(nèi)在聯(lián)系和可能的影響環(huán)節(jié)將具有明顯的理論意義和臨床應(yīng)用前景。

[1] Li QQ，Xu JD，Wang WJ，et al.Twist1-mediated adriamycin-induced epithelial-mesenchymal transition relates to multidrug resistance and invasive potential in breast cancer cells〔J〕.Clin Cancer Res，2009，15(8)：2657-2665.

[2] Loo TW，Clarke DM.Recent progress in understanding the- mechanism of P-glycoprotein-mediated drug efflux〔J〕.J Membr Biol，2005，206(3)：173-185.

[3] Biswas C，Zhang Y，DeCastm R，et al.The human tumor ce-ll-derived collagenase stimulatory factor(renamed EMMPRIN)is a member of the immunoglobulin superfamily〔J〕.Cancer Res，1995，55(2)：434-439.

[4] Sameshima T，Nabeshima K，Toole BP，et al.Glioma cell e- xtracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN)(CD147)stimulates production of membrane-type matrix metalloproteinases and activated gelatinase A in co-cultures with brain-derived fibroblasts〔J〕.Cancer Lett，2000，157 (2)：177-184.

[5] Kanekura T，Chen X，Kanzaki T.Basigin(CD147)is expressed on melanoma cells and induces tumor cell invasion by stimulating production of matrix metalloproteinases by fibroblasts〔J〕.Int J Cancer，2002，99(4)：520-528.

[6] 陳 翔，林 靜，林 偉，等.CD147 siRNA對惡性黑素瘤細(xì)胞株A375增殖及CD147表達(dá)的影響〔J〕.中華皮膚科雜志，2006，39(4)：204-206.

[7] 王善偉，陳麗榮.CD147、MMP-9和P-ERK在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義〔J〕.實(shí)用腫瘤雜志，2007，22(2)：133-137.

[8] Zucker S，Hymowitz M，Rollo EE，et al.Tumorigenic potential of extracellular matrix metalloproteinase inducer〔J〕.Am J Pathol，2001，l58(6)：1921-1928.

[9] Li QQ，Wang WJ，Xu JD，et al.Involvement of CD147 in regulation of multidrug resistance to P-gp substrate drugs and in vitro invasion in breast cancer cells〔J〕.Cancer Sci，2007，98(7)：1064-1069.

[10] Tang W，Chang SB，and Hemler ME.Links between CD147 function，glycosylation，and caveolin-1〔J〕.Mol Biol Cell，2004，15(9)：4043-4050.

[11] Lee JM，Dedhar S，Kalluri R，et al.The epithelial-mesench- ymal transition：new insights in signaling，development，and disease〔J〕.J Cell Biol，2006，172(7)：973-981.