劉錦宙，楊燕，李學(xué)良

（1.江西省宜春市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江西宜春336000；2.江西省宜春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西宜春336000；3.南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)部，江蘇南京210029）

Nesfatin-1對大鼠胃粘膜胃酸和胃蛋白酶分泌機(jī)制的研究

劉錦宙1，楊燕2，李學(xué)良3

（1.江西省宜春市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江西宜春336000；2.江西省宜春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西宜春336000；3.南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)部，江蘇南京210029）

目的觀察Nesfatin-1對大鼠的胃蛋白酶和胃粘膜胃酸分泌的影響，并探究影響分泌的作用機(jī)制。方法18只成功側(cè)腦室置管雄性SD大鼠，分為高劑量組、低劑量組和對照組，分別在側(cè)腦室注射Nesfatin-1（0.05μg／只）、（0.5μg／只）及等體積的滅菌水（5μL／只）。采用幽門結(jié)扎法收集胃液，3 h后處死大鼠，測定其胃酸和胃蛋白酶的變化，并用RT-PCR法檢測胃組織中H＋-K＋-ATP酶的表達(dá)量，用Western blot檢測胃黏膜中組胺酸脫羧酶（histidine decarboxylase，HDC）蛋白的表達(dá)水平，ELISA法檢測胃體黏膜中組胺的含量。結(jié)果大鼠注射Nesfatin-1 3 h后，與注射等體積的滅菌水的對照組相比，大鼠胃酸和胃蛋白酶的分泌量分泌量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。且給藥的2組之間胃蛋白酶分泌量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。大鼠胃粘膜中的組胺分泌下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組相比，給藥后，2組大鼠胃H＋-K＋-ATP酶mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。同時(shí)HDC蛋白在高劑量組和低劑量組大鼠胃粘膜中的表達(dá)顯著下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論側(cè)腦室注射Nesfatin-1，可以明顯抑制大鼠胃酸和胃蛋白酶的分泌，其作用機(jī)制可能是通過影響中樞神經(jīng)、H＋-K＋-ATP酶mRNA的表達(dá)量、組胺合成通路中關(guān)鍵酶的表達(dá)抑制胃酸分泌。

側(cè)腦室注射；大鼠；胃酸；胃蛋白酶

Nesfatin-1是由日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)的一種來源于核組蛋白2（nuclear histone 2，NMCB 2）的新厭食肽［1］，其表達(dá)于多種組織中。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在調(diào)節(jié)代謝和攝食的下丘腦和腦干中的部分神經(jīng)核團(tuán)細(xì)胞中nesfatin-1呈現(xiàn)陽性表達(dá)，包括下丘腦室旁核、弓狀核、孤束核和動眼神經(jīng)副核［2-3］等。外周組織，十二指腸、胰島、睪丸、以及胃粘膜內(nèi)分泌細(xì)胞中有部分細(xì)胞陽性表達(dá)nesfatin-1［4-5］。其中以胃腸道細(xì)胞中nesfatin-1表達(dá)程度最強(qiáng)。對于nesfatin-1抑制攝食的作用，研究發(fā)現(xiàn)是通過非依賴于瘦素的機(jī)制，也可能作用于MC3／MC4-CRF2的通路［6］以及催產(chǎn)素通路［7］發(fā)揮抑制攝食作用。目前研究發(fā)現(xiàn)中樞注射nesfatin-1可以明顯抑制大鼠胃酸分泌，分析表明nesfatin-1參與了調(diào)節(jié)胃黏膜酸分泌［8］，但其作用機(jī)制的研究文獻(xiàn)報(bào)道較少，本研究通過將nesfatin-1注射到側(cè)腦室，研究nesfatin-1對大鼠胃酸和胃蛋白酶的作用，并同時(shí)觀察胃組織中H＋-K＋-ATPase的表達(dá)、胃粘膜組織中組氨酸脫酸酶的表達(dá)以及組胺表達(dá)水平的變化，來探究nesfatin-1影響胃蛋白酶和胃酸分泌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～240 g，動物購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號：SYXK（皖）2012-002。動物飼養(yǎng)條件：溫度22℃左右，動物自由飲食飲水，動物室保持自然光暗周期。

1.2 主要試劑與儀器 Nesfatin-1（Phoneix Pharmaceuticals公司）；小鼠抗大鼠單克隆H＋-K＋-ATPase beta抗體（Abcam公司）；BCA蛋白測定試劑盒（Invitrogen公司）；HDC和Actin引物（上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司）；抗HDC抗體（Abcam公司）；抗Actin（Bioword公司）；胃蛋白酶檢測試劑盒（上海綠葉生物技術(shù)有限公司）。Trizol試劑（Invitrogen公司）；水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；大鼠腦立體定位儀、套管芯和套管、開腦顱鉆（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；微量注射器（上海關(guān)正醫(yī)療儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠側(cè)腦室置管：水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠麻醉后將大鼠固定于腦立體定位儀，用顱鉆在右側(cè)大腦開洞，把套管置進(jìn)右側(cè)腦室，用膠水將套管固定在顱骨上。置管后大鼠恢復(fù)7天，待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用注射器通過套管往大腦中注入美藍(lán)溶液，將腦組織取出，規(guī)定大鼠腦室內(nèi)壁如都染有美藍(lán)顏色的大鼠所得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是有效實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.3.2 分組及給藥：將置管成功的大鼠分為3組，每組大鼠6只，分別為高劑量組、低劑量組和對照組，所注射的藥物及計(jì)量依次為：nesfatin-1 0.5 g／只、nesfatin-1 0.05 g／只、滅菌水5 μL／只。在給藥3小時(shí)后將各組大鼠處死，收集胃液和胃組織，并將為組織保存于液氮中。

1.3.3 胃酸的測定：用酸堿滴定法檢測胃酸的分泌量。將從3組大鼠胃中收集的胃液1m L置于燒杯中，滴加兩滴酚酞指示劑，用精確濃度的NaOH滴定，邊滴加NaOH邊晃動燒杯，待酚酞指示劑顏色消失時(shí)記錄NaOH的消耗量，通過計(jì)算得出胃酸的濃度，再用胃酸濃度與所收集的胃液量相乘，所的到的乘積即為胃酸的分泌量。

1.3.4 胃蛋白酶的測定：取雞蛋清，并打勻蛋清，過濾，然后再取毛細(xì)玻璃管，用打勻過濾后的蛋清將毛細(xì)玻璃管灌滿，再將灌滿的毛細(xì)玻璃管用85℃熱水將管中的蛋清凝固，保存于冰箱中備后用。分別將1mL所收集的各組大鼠胃液置于燒瓶中，加入15mL的0.05mol／L的鹽酸，再將先前制備的凝固后的蛋清毛細(xì)玻璃管兩根放入燒瓶中，封口燒瓶，將燒瓶放入37℃的恒溫箱中孵育24 h，孵育后將蛋白管取出，測量毛細(xì)玻璃管兩端透明的長度，再求出這四透明端長度的平均值L。

大鼠胃蛋白酶活性單位＝L2×16，大鼠胃蛋白酶排出量＝大鼠胃蛋白酶活性單位×胃液量／5［10］。

1.3.5 RT-PCR檢測H＋-K＋-ATP酶mRNA的表達(dá)量：提取3組大鼠胃粘膜中總的mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄生成為為cDNA，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5 min，變性95℃，45 s，退火56℃，30 s，延伸72℃，30 s，共32個(gè)循環(huán)；終末延伸72℃，10 min。H＋-K＋-ATP酶上下游引物：上游引物5′-CTCTGCTTTGCGGGACTT-3′；下游引物5′-CCTTGGCTGTGATGGGAT-3′，以Actin為內(nèi)參照。PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳，觀察、拍照。

1.3.6 Western blot檢測HDC蛋白表達(dá)：裂解3組大鼠的胃粘膜組織，提取胃粘膜組織中的總蛋白。再用BCA法對所提取的總蛋白進(jìn)行定量。每孔上樣20μL體積的蛋白上清液與蛋白上樣緩沖液的混合液，再在12%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，待目的蛋白充分分離后將目的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜（PVDF膜）；5%脫脂奶粉封閉2 h；PBST反復(fù)洗膜3次，10min／次；加入一抗，分別為抗HDC抗體和抗Actin抗體，在4℃冰箱中過夜孵育；在二抗中常溫孵育1 h；用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，的位置涂布ECL，在暗室中曝光成像到膠片中；掃描分析。

1.3.7 ELISA法檢測胃黏膜中組胺的表達(dá)量：參照ELISA試劑盒使用說明檢測各組大鼠胃粘膜中組胺的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用±s”表示，正態(tài)資料組間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)采用單因素方差分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nesfatin-1側(cè)腦室注射對大鼠胃酸和胃蛋白酶分泌的影響 與對照組相比，高劑量組和低劑量組大鼠給藥3 h后胃液中的胃酸含量和胃蛋白酶的分泌量減少，高劑量組與低劑量組和對照組的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見表1）。高劑量組與低劑量組2組胃酸分泌量相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高劑量組胃蛋白酶分泌量少于低劑量組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 RT-PCR檢測H＋-K＋-ATP酶mRNA的表達(dá)量 與對照組相比，結(jié)果顯示給藥的2組大鼠胃H＋-K＋-ATP酶mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見圖1）。但給藥組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 Nesfatin-1側(cè)腦室注射對大鼠胃H＋-K＋-ATP酶mRNA表達(dá)的影響1.正常對照組；2.給藥組（0.05 g／只）；3.給藥組（0.5 g／只）＃P＜0.05，與正常對照組比較Fig.1 Effect of nesfatin-1 on rats gastric H＋-K＋-ATPasemRNA expression1.Control group；2.Dose group（0.05 g／rat）；3.Dose group（0.5 g／rat）＃P＜0.05，compared with control group

2.3 Western blot檢測HDC蛋白表達(dá) 大鼠側(cè)腦室注射nesfatin-1（0.05 g／只及0.5 g／只）后，采用Western blot檢測HDC蛋白表達(dá)情況。與對照組相比，結(jié)果顯示給藥的2組大鼠在3 h后胃粘膜中的HDC蛋白表達(dá)明顯下降，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但給藥組之間無差異性，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明隨著大鼠側(cè)腦注射nesfatin-1劑量的增加，胃粘膜中的HDC蛋白表達(dá)并不呈現(xiàn)劑量依賴性下降。具體結(jié)果見圖2。

圖2 Nesfatin-1側(cè)腦室注射對大鼠胃黏膜HDC蛋白表達(dá)的影響（n＝6）1.正常對照組；2.給藥組（0.05 g／只）；3.給藥組（0.5 g／只）Tab.2 Effect of nesfatin-1on protein expression of HDC（n＝6）1.Control group；2.Dose group（0.05 g／rat）；3.Dose group（0.5 g／rat）＃P＜0.05，與對照組比較，compared with control group

2.4 Nesfatin-1對大鼠胃黏膜中組胺含量的影響 大鼠側(cè)腦室注射nesfatin-1（0.05 g／只及0.5 g／只）3 h后，給藥的2組大鼠胃粘膜中的組胺分泌下降，高劑量組與低劑量組和對照組的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且給藥組之間也存在差異性，即高劑量組大鼠胃粘膜中組胺的分泌量明顯少于低劑量組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

表3 Nesfatin-1對大鼠胃黏膜中組胺含量的影響（n＝6）Tab.3 Effect of nesfatin-1on the expression of histamine in gastric mucosa（n＝6）

3 討論

Nesfatin-1是日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)的一種新的厭食肽，包含82個(gè)氨基酸，起源于核組蛋白2（NMCB 2）。NΜCB2在激素原轉(zhuǎn)化酶的作用下水解為N-端片段nesfatin-1和2個(gè)C-端肽Nesfatin-2和Nesfatin-3。但只有nesfatin-1能夠抑制大鼠的攝食量和體重的增加。Nesfatin-1表達(dá)于下丘腦弓狀核、室旁核、腦干的迷走神經(jīng)背核、孤束核以及胃、胰腺、十二指腸等外周組織中。Nesfatin-1可以調(diào)節(jié)多種生理活動，包括抑制攝食、能量調(diào)節(jié)、胃腸運(yùn)動和胃粘膜的保護(hù)作用［2］等。研究發(fā)現(xiàn)：nesfatin-1主要與胃泌酸腺的中間部分的X／A樣細(xì)胞分泌的ghrelin共存，nesfatin-1還在泌酸腺基底部的少數(shù)細(xì)胞中與生長抑素和組氨酸脫羧酶共存［11］。提示nesfatin-1在胃粘膜的分泌功能中起著重要作用。

多種激素和中樞神經(jīng)相互協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)胃酸分泌。調(diào)節(jié)胃酸分泌的主要神經(jīng)核團(tuán)有孤束核、下丘腦以及迷走神經(jīng)運(yùn)動背核，迷走神經(jīng)運(yùn)動背核是胃酸分泌的主要中樞調(diào)節(jié)沖動來源，這部分的中樞神經(jīng)沖動經(jīng)過迷走神經(jīng)先將神經(jīng)沖動傳導(dǎo)至胃壁腸神經(jīng)系，再通過腸神經(jīng)系將神經(jīng)沖動傳導(dǎo)至胃腺迷走神經(jīng)運(yùn)動背核，對來自于孤束核的內(nèi)臟感覺傳入和下丘腦的中樞感覺傳入進(jìn)行系統(tǒng)的整合，進(jìn)而調(diào)節(jié)胃酸分泌［12］。

外周調(diào)節(jié)胃酸分泌主要通過食物進(jìn)入而導(dǎo)致胃的一系列的變化，包括胃胃腸蠕動、機(jī)械擴(kuò)張胃體和食糜入腸激活腸的內(nèi)分泌系統(tǒng)進(jìn)而調(diào)節(jié)胃酸分泌。外周調(diào)節(jié)胃酸的分泌主要通過調(diào)節(jié)多種物質(zhì)的分泌來實(shí)現(xiàn)，這些物質(zhì)主要有胃泌素、組胺和乙酰膽堿，這3種主要泌酸因子可分別與相應(yīng)的受體結(jié)合，通過其下游信號通路，刺激胃酸分泌［13］。本研究顯示，大鼠側(cè)腦注射nesfatin-1后，不僅可以降低胃酸和胃蛋白酶的分泌量，同時(shí)可以抑制胃粘膜中組胺合成的關(guān)鍵酶組氨脫羧酶的基因和蛋白的表達(dá)，通過這一抑制作用，影響組胺的合成，導(dǎo)致大鼠胃粘膜中的組胺量降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，nesfatin-1通過對組氨脫酸酶的抑制，影響組胺的合成及釋放，可能產(chǎn)生抑制胃酸和胃蛋白酶的作用。其是通過直接抑制組胺合成還是減少胃泌素的合成間接抑制組胺的合成，需要進(jìn)一步深入研究。

胃酸分泌的關(guān)鍵酶之一是H＋-K＋-ATP酶，該酶通過自身去磷酸化和磷酸化，將細(xì)胞外液中的K＋主動運(yùn)入至細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)將細(xì)胞內(nèi)的H＋泵出細(xì)胞外，實(shí)現(xiàn)H＋／K＋跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及胃酸的分泌。國外研究表明H＋-K＋-ATP酶的表達(dá)變化與胃酸分泌能力一致，國內(nèi)也證實(shí)這種情況［14］。因此本研究選取測定該酶的表達(dá)情況來反映胃蛋白酶和胃酸的分泌情況。結(jié)果顯示，大鼠注射nesfatin-1后，大鼠胃中H＋-K＋-ATP酶的表達(dá)出現(xiàn)明顯下降，胃酸分泌能力也隨之降低。提示大鼠側(cè)腦室注射nesfatin-1，通過降低H＋-K＋-ATP酶的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制胃酸分泌的能力。

如上所述，胃酸分泌調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及的神經(jīng)系統(tǒng)和重要的調(diào)節(jié)因子較多。最新研究表明nesfatin-1很可能通過激活迷走神經(jīng)進(jìn)而使得胃酸的分泌得到抑制，但這個(gè)抑制過程是通過直接作用于壁細(xì)胞，還是通過間接作用于胃黏膜其他細(xì)胞，抑或通過作用于何種受體，目前尚未清楚，還深入研究［15-16］。但總的來說，大鼠側(cè)腦室注射nesfatin-1，可以抑制大鼠胃粘膜中胃酸和胃蛋白酶的分泌，并可以降低胃中H＋-K＋-ATP酶的表達(dá)、組胺合成關(guān)鍵酶組氨脫羧酶的表達(dá)以及組胺的含量。其機(jī)制可能與中樞系統(tǒng)、H＋-K＋-ATP酶的表達(dá)以及影響組胺合成途徑有關(guān)。

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（編校：譚玲）

Research on mechanism of nesfatin-1 in secreting gastric acid and pepsin in rat gastric mucosa

LIU Jin-zhou1，YANG Yan2，LIXue-liang3

（1.Department of Internal Medicine，Yichun People's Hospital of Jiangxi Province，Yichun 336000，China；2.Yichun Vocational Technical College，Yichun 336000，China；3.Department of Medical Sciences，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo observe nesfatin-1 on gastric acid and pepsin secretion in rats gastric mucosa，and explore its possible mechanism.MethodsMale SD rats after intracerebroventricular catheter，respectively，in the lateral ventricle injection of nesfatin-1（0.05μg／rat），（0.5μg／rat）and an equal volume of sterile water（5μL／rat）.Used of collected gastric pylorus ligation，3 h after the ratswere sacrificed，measured changes in their gastric acid and pepsin，and was detected by RT-PCR in gastric tissue H＋-K＋-ATPase expression levels，detected by Western blot gastric mucosa histidine decarboxylase（histidine decarboxylase，HDC）expression levels of proteins，ELISA was used to detect gastric body mucosa histamine content.ResultsAfter injection nesfatin-1 3h in rats，compared with an equal volume of sterilewater for injection control group，the secretion of gastric acid and pepsin secretion was significantly reduced，and there was a significant difference（P＜0.01）.There were differences between the two groups and the administration of pepsin secretion，with statistical significance（P＜0.05）.Histamine secretion in rat gastric mucosa declined，there was a statistically significant difference（P＜0.05）.Compared with the control group，after administration，two groups of rats gastric H＋-K＋-ATP enzyme mRNA expression was significantly reduced，and there was a significant difference（P＜0.01）.Meanwhile protein expression in rat gastric mucosa HDC groups decreased significantly compared with the control group，with statistical significance（P＜0.05）.ConclusionIntracerebroventricular injection of nesfatin-1 could inhibit gastric acid and pepsin secretion，and itsmechanism of actionmay inhibit secretion of gastric acid through affecting the central nervous system，expression levels of H＋-K＋-ATP enzymemRNA，expression of key enzymes in histamine synthesis pathway.

lateral ventricle injection；rat；acid；pepsin

R573

A

1005－1678（2014）09－0046－04

國家自然科學(xué)基金（81070308）

劉錦宙，男，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：消化內(nèi)科，E-mail：qch1821460064＠163.com。