舒 艷，蔡 穎，況九龍

（南昌大學第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，南昌330006）

氣道上皮細胞具有活躍的分泌功能，在外界因素的干預作用下，可以釋放多種炎癥因子，包括趨化因子如單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1MCP-1），生長因子如人粒巨噬細胞集落刺激因子（human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF），轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF），其他因子如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），細胞間黏附分子（human intercellu-lar adhesion molecule，ICAM），血管細胞黏附分子等[1-5]。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）作為革蘭陰性細菌細胞壁成分在人類工作或生活中無處不在，是一種具有強烈免疫調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)，能夠誘導抗原提呈細胞產(chǎn)生IL-12和IFN-γ，促進TH1型反應而抑制TH2型反應[6]，LPS還可以誘導CD14和TLR4信號通路激活固有免疫系統(tǒng)，從而活化轉(zhuǎn)錄因子NF-kB誘發(fā)炎性反應[7]。LPS是否通過影響氣道上皮細胞MCP-1、TGF-β、TNF-α、ICAM-1和ICAM-2的分泌，從而參與氣道的炎性反應，目前國內(nèi)外文獻尚缺乏相關報道。本實驗通過采用不同濃度LPS干預氣道上皮細胞不同時間后檢測A549細胞MCP-1、TGF-β、TNF-α、ICAM-1和ICAM-2的分泌量的變化，從而為闡述氣道炎性反應機制提供更多的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 高糖雙抗DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、LPS、凍存液，均購于北京Solarbio科技有限公司；胎牛血清，浙江天航生物科技有限公司；ELISA試劑盒，上海森熊科技實業(yè)有限公司。細胞培養(yǎng)基[取含高糖雙抗（抗青霉素及鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基90mL，并加入胎牛血清10mL配成100mL的培養(yǎng)基]；胰酶（準確稱取胰酶0.25g，并將其溶于100mL PBS溶液中）；LPS（將購買的來源于大腸桿菌O55：B5菌株的脂多糖10mg用PBS稀釋配置成濃度為1mg／mL并分裝至EP管內(nèi)放置于-20℃冰箱內(nèi)保存，待使用時解凍并用血清配置成干預濃度）。

1.2 方法 分別采用煮沸、涮洗、泡酸等物理和化學方法消毒實驗玻璃器械。在紫外燈消毒超凈工作臺內(nèi)進行細胞換液、傳代、細胞凍存、細胞復蘇及LPS干預（使脂多糖的終濃度為0、0.1、1.0、10.0、20.0、30.0、50.0μg／mL和100μg／mL，干預時間分別為2、4、8、24、30h）。直接收集藥物干預后的細胞上清液，備用于ELISA檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以±s表示，應用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各個時相點不同濃度LPS干預A549細胞后各因子分泌量的均數(shù)變化趨勢圖 在LPS干預濃度為20.0μg／mL，干預時間為4h和8h時，ICAM-1的分泌量達到峰值，見圖1；LPS干預濃度為50.0μg／mL，干預時間為4h時，MCP-1的分泌量達到峰值，見圖2；在其他時間點及LPS干預濃度，各炎癥因子分泌量變化趨勢不明顯，見圖3～5。

圖1 ICAM-1平均數(shù)變化趨勢圖

2.2 各個時相點不同濃度LPS干預A549細胞后各因子分泌量方差分析的結果 不同濃度LPS在各個時相點干預A549細胞后其差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），LPS能夠干預TGF-β、TNF-α、MCP-1、ICAM-1、ICAM-2的分泌，見表1。

圖2 MCP-1平均數(shù)變化趨勢圖

圖3 ICAM-2平均數(shù)變化趨勢圖

圖4 TGF-β平均數(shù)變化趨勢圖

圖5 TNF-α平均數(shù)變化趨勢圖

2.3 各個時相點各因子分泌量達到最大（?。r與空白對照組比較的直方圖 在干預時間為30h時，ICAM-2分泌量最大時與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在其余各時相點，ICAM-2分泌量最大時與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；在干預時間為30h時，TGF-β有一個分泌量最小時的LPS干預濃度，且其與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；在其余各時相點，TGF-β分泌量最大時與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；在各個時相點，TNF-α、MCP-1、ICAM-1均存在一個分泌量達到最大時的LPS干預濃度，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖6～10。

表1 各個時相點不同濃度LPS干預A549細胞后炎癥因子變化的結果（±s）

表1 各個時相點不同濃度LPS干預A549細胞后炎癥因子變化的結果（±s）

2h 4h 8h 24h 30h ICAM-1 0.085 0±0.006 0 0.096 0±0.027 4 0.092 0±項目0.029 9 0.085 0±0.004 4 0.084 0±0.003 1 F 1 081.122 15.393 52.409 451.308 94.776 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ICAM-2 0.118 0±0.005 3 0.117 0±0.008 5 0.117 0±0.006 5 0.117 0±0.008 2 0.117 0±0.009 3 F 71.326 256.959 332.867 994.857 474.568 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 MCP-1 0.226 0±0.101 7 0.124 0±0.050 0 0.188 0±0.045 3 0.122 0±0.026 0 0.430 0±0.087 6

續(xù)表1 各個時相點不同濃度LPS干預A549細胞后炎癥因子變化的結果（±s）

續(xù)表1 各個時相點不同濃度LPS干預A549細胞后炎癥因子變化的結果（±s）

2h 4h 8h 24h 30h F 47 488.271 11 607.497 8 229.743 3 765.014 645.0項目70 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 TGF-β 0.098 0±0.007 4 0.101 0±0.055 2 0.082 0±0.002 3 0.081 0±0.006 1 0.086 0±0.004 3 F 897.693 42.166 59.714 116.237 238.924 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 TNF-α 0.095 0±0.012 0 0.095 0±0.006 5 0.093 0±0.008 8 0.093 0±0.005 6 0.098 0±0.006 9 F 167.594 67.844 1 273.894 255.865 773.153 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖6 ICAM-1分泌量最大時與空白對照組比較的直方圖

圖7 ICAM-W分泌量最大時與空白對照組比較的直方圖

圖8 TGF-β分泌量最大（小）時與空白對照組比較的直方圖

圖9 MCP-1分泌量最大時與空白對照組比較的直方圖

圖10 TNF-α分泌量最大時與空白對照組比較的直方圖

3 討論

本實驗主要是研究不同時相點不同濃度LPS對氣道上皮細胞分泌MCP-1、TGF-β、TNF-α、ICAM-1和ICAM-2的影響，分析炎癥因子分泌量的變化，從而為探索氣道炎癥機制提供理論基礎。

研究表明LPS可以通過TNF-α、IL-1β、誘生型一氧化氮合酶等影響巨噬細胞功能[8]，而Muller-Decker等[9]在用LPS刺激小鼠舌源性上皮細胞系的實驗中發(fā)現(xiàn)LPS并沒有通過內(nèi)源性炎癥因子如TNF-α、TGF-β等影響上皮細胞功能，而本研究發(fā)現(xiàn)LPS可以干預氣道上皮細胞對炎癥因子MCP-1、TGF-β、TNF-α、ICAM-1和ICAM-2的分泌。對氣道上皮細胞的研究中發(fā)現(xiàn)LPS能夠干預氣道上皮細胞分泌MCP-1，在LPS干預濃度為50.0μg／mL，干預時間為4h時，MCP-1的分泌量達到一個峰值，與上述結果相似；而且在各個時相點，都存在一個最佳的LPS干預濃度使MCP-1的分泌量達到最大，這就說明MCP-1可能在氣道上皮細胞發(fā)生炎癥的過程中起著重要作用。用LPS作為刺激因素建造的人體或是動物呼吸系統(tǒng)損傷模型都是以支氣管肺泡內(nèi)中性粒細胞灌注和炎癥因子分泌增多為特征的，而且這個特征已經(jīng)被用于檢測新的抗炎藥物[10]；激活的巨噬細胞和上皮細胞能夠產(chǎn)生炎癥因子如TNF-α和IL-1β，這些炎癥介質(zhì)又可以誘導包括IL-6在內(nèi)的其他炎癥因子的釋放[11]；本研究也發(fā)現(xiàn)LPS能夠干預氣道上皮細胞TNF-α的分泌，且TNF-α的分泌量與LPS的干預濃度有關，在各個時相點，都存在一個最佳的LPS干預濃度，與上述結果基本一致。牟海波等[12]研究發(fā)現(xiàn)在樹突狀細胞的培養(yǎng)體系中加入TGF-β能夠培養(yǎng)出更為幼稚的樹突狀細胞，且此種細胞對LPS的刺激呈現(xiàn)一種低反應性；近年來也有研究發(fā)現(xiàn)LPS可以通過LPS結合蛋白促進細胞釋放炎癥因子TGF-β和IFN-γ[13]；本研究結果跟上述結果基本一致，本研究也發(fā)現(xiàn)LPS能夠干預氣道上皮細胞分泌TGF-β；萬力等[14]研究發(fā)現(xiàn)一定濃度（0.005～0.100μg／mL）LPS干預并傳代后成纖維細胞TGF-β分泌量增加的同時，IFN-γ分泌量降低，且呈量效依賴關系，隨著LPS干預濃度的增加（0.5μg／mL），上述干預作用開始下降，當刺激濃度達到1.0μg／mL時，則呈相反作用，也就是說TGF-β分泌量下降而IFN-γ分泌量開始升高；本研究也發(fā)現(xiàn)TGF-β的分泌量跟LPS的干預濃度有關，而且跟LPS的干預時間也有關系，干預時間為24h內(nèi)（包括24h）時，TGF-β的分泌量達到最大有一個最佳的LPS干預濃度，而在干預時間為30h時，TGF-β的分泌量反而出現(xiàn)下降趨勢；而且還有人認為TGF-β缺乏的小鼠在生存的3周內(nèi)就會發(fā)生全身炎性反應，而且這種炎性反應和小腸上皮細胞功能紊亂有關[15]；目前，多數(shù)學者認為，肝臟的缺血再灌注損傷的核心仍然是炎性反應，主要由炎癥細胞介導。ICAM-1通過與其配體LFA-1結合，啟動細胞黏附和活化，使中性粒細胞牢固地黏附于血管壁；還有研究顯示ICAM-1可以介導中性粒細胞通過內(nèi)皮細胞全層，遷移至肝實質(zhì)細胞，釋放蛋白酶和反應性氧原子，造成肝細胞損傷[16]；而在氣道上皮細胞中對ICAM炎癥因子家族的研究相對較少，而本研究對ICAM-1和ICAM-2同時做了研究，發(fā)現(xiàn)LPS能夠干預氣道上皮細胞分泌ICAM-1和ICAM-2，在LPS干預濃度為20.0μg／mL，干預時間為4、8h時，ICAM-1的分泌量可以達到峰值，而且在各個時相點，ICAM-1的分泌量均增加，且存在一個最佳的LPS干預濃度；而ICAM-2在除干預時間為30h以外的各時相點才和ICAM-1分泌量的變化表現(xiàn)一致。

本研究通過不同濃度的LPS在不同時相點干預A549細胞，并分析炎癥因子TGF-β、TNF-α、MCP-1、ICAM-1和ICAM-2分泌量的變化，發(fā)現(xiàn)LPS可以對氣道上皮細胞TGF-β，MCP-1，TNF-α，ICAM-1和ICAM-2的分泌量產(chǎn)生影響，而且上述炎癥因子分泌量和LPS的干預濃度及干預時間有關，這就說明氣道炎癥性疾病的發(fā)生與各種損傷性刺激的強度和時間密切相關，而且他還提示在疾病發(fā)生的合適時機對疾病進行干預可能會起到更好的治療作用。

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