田夢(mèng)秋，袁東杰，鄭實(shí)興，李慶玉，石書婧，徐志文△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，廣西南寧530021；2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院耳鼻喉科，湖南衡陽(yáng)421002）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）是頭頸部常見的惡性腫瘤，高發(fā)于我國(guó)湖南、廣東和廣西等地［1］。98%屬于低分化鱗狀細(xì)胞癌，因此目前早期鼻咽癌以放射治療為主，晚期通過高強(qiáng)度放化療雖然能夠有效控制和殺滅腫瘤細(xì)胞，但放化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也造成增殖活躍的正常組織干細(xì)胞的損傷，引起諸多毒副反應(yīng)，5年生存率只有40%［2］，因此安全有效的藥物治療是臨床迫切需要解決的問題。

研究報(bào)道，天然綠茶提取物茶多酚，已被證實(shí)有抗癌等藥理作用［3-4］，對(duì)正常組織細(xì)胞沒有毒性［5］，其作用通過抑制基因表達(dá)及相關(guān)酶的活性、提高機(jī)體免疫功能和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等機(jī)制來實(shí)現(xiàn)［6］，目前茶多酚抑制鼻咽癌血管生成方面的研究目前還較少。腫瘤組織微血管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移的前提和基礎(chǔ)，因此抗血管形成治療是控制腫瘤生長(zhǎng)非常有潛力的治療方法。本實(shí)驗(yàn)旨在研究茶多酚體內(nèi)抗鼻咽癌作用及其對(duì)血管生成的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1：廣西醫(yī)科大學(xué)耳鼻喉實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。動(dòng)物：BALB／C雄性裸鼠18只，4～6周齡，體質(zhì)量（20±2）g，廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（桂）2009-0002，飼養(yǎng)于無特定病原體（specific pathogen free，SPF）環(huán)境中。

1.2 藥物及儀器 茶多酚：黃褐色粉末，純度98%，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone公司），小牛血清（Gibco公司），青鏈霉素雙抗溶液（Solarbio公司），胰蛋白酶（Solarbio公司），HRP 標(biāo)記GAPDH（康成公司）、兔抗VEGF（proteintech 公司），HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（聯(lián) 科 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche公司），7300型定量PCR 儀（ABI公司），RIPA 裂解液（碧云天公司），Trizol（Invitrogen公司），PCR引物（Invitrogen公司合成），BCA 蛋白濃度測(cè)量試劑盒（碧云天公司），SDS-聚丙烯酰胺（雙螺旋公司），Tris（Sigma公司），ECL顯影液（Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 裸鼠移植瘤模型的建立與給藥 人鼻咽癌敏感細(xì)胞株HONE1，常規(guī)體外培養(yǎng)，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)胰酶消化、離心后，用無血清的RPMI1640 培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，濃度為1×107／mL，裸鼠右前腋皮下接種細(xì)胞懸液，每只0.2mL（無菌操作），接種后每天同一時(shí)間觀察，造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為瘤塊觸之質(zhì)硬且長(zhǎng)徑大于5mm。將造模成功的18只裸鼠隨機(jī)分為3組，對(duì)照組：0.1mL／10g生理鹽水；低劑量組：7.5mg／kg茶多酚；高劑量組：30.0mg／kg茶多酚，每組6 只，腹腔注射給藥，隔日1次，共7次。

1.3.2 移植瘤生長(zhǎng)情況觀察 隔日測(cè)量裸鼠體質(zhì)量、移植瘤最長(zhǎng)徑（a）及最短徑（b），按照公式V＝a×b2／2計(jì)算移植瘤體積，繪制生長(zhǎng)曲線。末次給藥第2天用頸椎脫臼法處死裸鼠，完整解剖出瘤塊，稱質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率（IR），《現(xiàn)代腫瘤治療藥物學(xué)》［7］中抗腫瘤藥物有效的標(biāo)準(zhǔn)為抑瘤率大于30%，IR（%）＝（1-治療組平均瘤質(zhì)量／對(duì)照組平均瘤質(zhì)量）×100%

1.3.3 RT-PCR法檢測(cè)VEGF mRNA 的表達(dá)情況 根據(jù)Trizol法提取3組裸鼠瘤組織總RNA。依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，ABI7300系統(tǒng)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，設(shè)計(jì)反應(yīng)體系為20μL。PCR 反應(yīng)所用引物序列見表1，以GAPDH 作為內(nèi)參照。擴(kuò)增結(jié)束后收集溶解曲線，以確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。基因表達(dá)分析采用Livak（2-△△Ct）法進(jìn)行，2-△△Ct值表示目的基因mRNA 表達(dá)的差異倍數(shù)，△△Ct＝實(shí)驗(yàn)組（Ct目的基因-CtGAPDH）-對(duì)照組（Ct目的基因-CtGAPDH），生理鹽水組為對(duì)照組。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的引物序列

1.3.4 Western blot法檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)差異 給藥滿7次后頸椎脫臼法處死裸鼠，剝離瘤結(jié)節(jié)，迅速稱質(zhì)量，取部分瘤組織RIPA 細(xì)胞裂解液提取蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。20μg 蛋白上樣，8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳跑膠分離，轉(zhuǎn)PVDF膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間60 min。5%脫脂牛奶室溫封閉2h，兔抗VEGF抗體4 ℃孵育過夜，洗膜，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體室溫標(biāo)記2h，1×TBST 充分洗膜后，ECL顯影液顯影，暗盒中壓片。Image J軟件分析Western blot圖片條帶吸光度，以GAPDH 為內(nèi)參照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANNOVA），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 茶多酚對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞HONE1裸鼠移植瘤生長(zhǎng)速度的影響 裸鼠接種人鼻咽癌細(xì)胞HONE1后，于第7天18只裸鼠全部達(dá)到造模標(biāo)準(zhǔn)。相對(duì)對(duì)照組，給藥組（高、低劑量組）腫瘤生長(zhǎng)均較慢，其中高劑量組最慢，見圖1。

圖1 茶多酚對(duì)人鼻咽癌HONE1裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

2.2 茶多酚對(duì)荷人鼻咽癌裸鼠移植瘤瘤重的影響 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：低劑量組平均抑瘤率為18.82%，高劑量組為47.66%，表明高劑量組茶多酚能有效抑制人鼻咽癌HONE1裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)，并呈濃度相關(guān)。而低劑量組抑瘤率為18.82%，效果不明顯，見表2。

表2 茶多酚對(duì)人鼻咽癌HONE1裸鼠移植的抑瘤率（n＝6）

2.3 RT-PCR 法檢測(cè)VEGF mRNA 相對(duì)表達(dá)量 濃度梯度茶多酚作用裸鼠后，移植瘤內(nèi)VEGF mRNA 表達(dá)水平下調(diào)，并呈濃度相關(guān)，低劑量組為0.78±0.05，高劑量組為0.32±0.12。其中高劑量組下調(diào)明顯，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 Western blot法檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)量 濃度梯度茶多酚作用裸鼠后，移植瘤內(nèi)VEGF 蛋白表達(dá)量下降。高劑量組蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 茶多酚對(duì)人鼻咽癌HONE1裸鼠移植瘤VEGF蛋白表達(dá)量影響

3 討 論

茶多酚占茶葉干質(zhì)量的30% 左右，特別在綠茶中水平較多，具有不良反應(yīng)小、普遍存在、易獲取等優(yōu)勢(shì)。研究證實(shí)茶多酚能抗腫瘤、抗氧化等多種功能，潛藏巨大的實(shí)用價(jià)值，可發(fā)展為新型的抗腫瘤治療藥物。我國(guó)茶葉原材料豐富，因此茶多酚的抗腫瘤前景非常可觀。

腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于瘤區(qū)血管豐富程度。研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)體瘤生長(zhǎng)至1 mm3以上如果沒有新生血管來提供氧和營(yíng)養(yǎng)，腫瘤將停滯于休眠狀態(tài)，也不發(fā)生轉(zhuǎn)移［8］，因而有效抑制血管新生，切斷腫瘤血供，有望成為腫瘤靶向治療的一個(gè)新途徑［9］。VEGF是最重要的促血管生長(zhǎng)因子之［10］，在血管生成過程中起關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用［11］，可由多種腫瘤細(xì)胞分泌，是目前已知的作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生長(zhǎng)因子，其作用包括增加血管通透性、促進(jìn)血管內(nèi)皮增生、增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞抗凋亡和刺激體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的遷移等，這些作用促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和新生血管的形成［12］。

本課題組前期研究已證實(shí)茶多酚體外能明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，且抑制作用呈濃度依賴關(guān)系［13］。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)迅速，而給藥組腫瘤生長(zhǎng)緩慢，高濃度組的抑瘤率為47.66%（與對(duì)照組比較，P＜0.05），提示高濃度茶多酚具有抑制人鼻咽癌細(xì)胞HONE1荷瘤裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的作用。為了進(jìn)一步明確茶多酚抑制鼻咽癌分子機(jī)制，本研究觀察茶多酚對(duì)鼻咽癌移植瘤組織VEGF 表 達(dá) 的 作 用，熒光定量PCR及Western blot法分別觀察茶多酚作用后移植瘤VEGF 在mRNA 及蛋白水平上的表達(dá)變化，結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，茶多酚可明顯下調(diào)VEGF的mRNA 和蛋白表達(dá)水平，呈濃度依賴性，其中高劑量組變化明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。由此推斷，茶多酚能夠抑制鼻咽癌腫瘤生成，可能通過在轉(zhuǎn)錄水平抑制VEGF mRNA 表達(dá)，減少VEGF 產(chǎn)物，從而抑制腫瘤血管生成等作用有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明茶多酚對(duì)人鼻咽癌HONE1裸鼠皮下移植瘤具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，為茶多酚應(yīng)用于鼻咽癌的臨床藥物治療提供依據(jù)，有望減少鼻咽癌放化療不良反應(yīng)，改善患者生活質(zhì)量。但這些功能在鼻咽癌的防治上仍未得到證明，是其今后在抗鼻咽癌研究的方向，由于目前缺乏完整的對(duì)茶多酚的毒理藥理學(xué)研究，并且對(duì)其組成成分沒能充分分離提純，大大限制了茶多酚研究，這也是今后研究的重點(diǎn)方向。

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