古 麗

（重慶市九龍坡區(qū)第五人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 409908）

結(jié)腸癌是消化道內(nèi)常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，在胃腸道腫瘤中的發(fā)病率占據(jù)第3位，對(duì)人類的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[1]。有研究指出紅細(xì)胞角蛋白19（CK19）與結(jié)腸癌間有著密切的聯(lián)系[2]。本研究旨在通過(guò)對(duì)結(jié)腸癌患者體內(nèi)外周血中CK19基因表達(dá)的檢測(cè)，探討CK19mRNA水平與結(jié)腸癌的臨床分期／分型、轉(zhuǎn)移以及診斷的關(guān)系，并通過(guò)比較實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)mRNA與腫瘤標(biāo)記物CEA和CA199對(duì)于結(jié)腸癌的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年3月至2014年5月在本院接受手術(shù)治療的結(jié)腸癌患者的臨床資料。所有結(jié)腸癌患者均需接受術(shù)后病理學(xué)的相關(guān)確診。并選取同期在本院接受檢查的健康者及結(jié)腸息肉患者。本研究共納入研究對(duì)象160例，其中結(jié)腸癌患者52（結(jié)腸癌組），結(jié)腸息肉患者55例（結(jié)腸息肉組），健康者53例（對(duì)照組），一般資料見(jiàn)表1，3組受試者一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 CK19mRNA的測(cè)定（q-PCR法） 獲取入組受試者的外周血樣本，并從每例中吸取5mL與枸櫞酸鈉抗凝或乙二胺四乙酸（EDTA）混勻；結(jié)合CK19基因序列，設(shè)計(jì)相關(guān)的探針和引物，同時(shí)要注意引物的相關(guān)特異性，防止擴(kuò)增假基因的出現(xiàn)；心外周血獲取核細(xì)胞，實(shí)施Trizol（深圳晶美生物工程有限公司）法對(duì)總核酸進(jìn)行提取，同時(shí)運(yùn)用紫外分光光度法對(duì)核酸的純度、濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)；對(duì)標(biāo)本中CK19內(nèi)的mRNA表達(dá)量實(shí)施實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)。引物序列，CK19上游引物：5′-ATG TGG TTA CCG TTC CGG GCC-3′，下游引物：5′-AGC TAT CGG TCC GTC AAG TA-3′，Taqman探針FAM-5′-AGG TAC CTA CTG CGT CAC GGT CAT TCC AT-3′。比較結(jié)腸癌、結(jié)腸息肉及健康人外周血CK19mRNA表達(dá)差異，分析CK19mRNA表達(dá)情況與結(jié)腸癌的腫瘤病理特征間的關(guān)系，并比較CK19mRNA與CEA和CA199對(duì)于結(jié)腸癌的診斷價(jià)值。

表1 3組受試者一般資料比較

1.2.2 RT-PCR 測(cè) 定反 應(yīng) 條 件：DNA 模 板；5mmol／L dNTP貯備液；10×PCR緩沖液；耐熱的DNA聚合酶；引物。定量方法：依據(jù)已知的起始拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲取未知樣品循環(huán)數(shù)（Ct值），在標(biāo)準(zhǔn)曲線上將樣品起始的濃度計(jì)算出。

1.2.3 測(cè)定血糖 鄰甲苯胺法，空腹全血為3.3～5.6 mmol／L，血漿是3.9～6.4mmol／L。檢測(cè)血清 C EA：酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）雙抗體夾心法。

1.2.4 血清CA199檢測(cè) 檢測(cè)血清CA199放射免疫分析法（IRMA）。

1.2.5 計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)（BMI） BMI＝體質(zhì)量（kg）÷身高2（m2）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，比較采用單因素方差檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)，CK19mRNA與CEA和CA199對(duì)于結(jié)腸癌的診斷價(jià)值采用ROC曲線分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組受試者的CK19mRNA陽(yáng)性表達(dá)比較 3組受試者RT-PCR所得的CK19mRNA陽(yáng)性表達(dá)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，結(jié)果提示3組受試者外周血的CK19mRNA陽(yáng)性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝54.53，P＜0.01），結(jié)腸癌組患者CK19mRNA陽(yáng)性表達(dá)最高。

表2 3組CK19mRNA陽(yáng)性表達(dá)量比較（n）

2.2 結(jié)腸癌患者的CK19mRNA陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤病理特征相關(guān)性 不同病理特征的結(jié)腸癌患者所對(duì)應(yīng)的外周血CK19 mRNA陽(yáng)性表達(dá)情況見(jiàn)表3，不同Dukes分期（χ2＝16.14，P＜0.01）、分化程度（χ2＝8.155，P＝0.017）、肝轉(zhuǎn)移情況（χ2＝13.68，P＜0.01）所對(duì)應(yīng)的結(jié)腸癌患者的CK19mRNA陽(yáng)性并不相同，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 結(jié)腸癌患者的CK19mRNA陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤病理特征相關(guān)性[n（%）]

2.3 CK19mRNA、CEA、CA199對(duì)于結(jié)腸癌的診斷價(jià)值比較 將CK19mRNA、CEA、CA199對(duì)于結(jié)腸癌的診斷價(jià)值行ROC曲線分析，結(jié)果見(jiàn)圖1、表4，CK19mRNA對(duì)于結(jié)腸癌的診斷價(jià)值曲線下面積為0.947，其敏感性和特異性均高于CEA和CA199。

表4 CEA、CA199、CK19mRNA對(duì)結(jié)腸癌的診斷意義

圖1 CEA、CA199、CK19mRNA對(duì)結(jié)腸癌的診斷意義

3 討論

結(jié)腸癌目前的治愈率并未得到顯著改善，其5年的存活率僅為60%，在結(jié)腸癌發(fā)現(xiàn)的同時(shí)部分患者已經(jīng)出現(xiàn)了肝轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，同時(shí)接受結(jié)腸癌根治術(shù)中仍有20%～50%的患者有肝轉(zhuǎn)移的情況出現(xiàn)，此可能是其中的一個(gè)原因[3]。故早期發(fā)現(xiàn)及診斷結(jié)腸癌是否發(fā)生了微轉(zhuǎn)移的情況是幫助結(jié)腸癌根治術(shù)患者提高生存率的核心。微轉(zhuǎn)移主要是指通過(guò)血液及淋巴，腫瘤細(xì)胞直接種植和侵襲于體腔內(nèi)或轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的器官或組織[4]。在明顯的病灶形成之前很難發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞。所以對(duì)轉(zhuǎn)移途徑有關(guān)聯(lián)的體腔內(nèi)積液、淋巴結(jié)、骨髓，以及血液的檢測(cè)對(duì)腫瘤的指導(dǎo)治療、預(yù)后判斷及診斷都有著極其重要的價(jià)值意義[5]。

屬于低相對(duì)分子質(zhì)量的CK是組成上皮組織中間絲的一種成分，在上皮起源及正常上皮的腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者的外周血中的CK mRNA能幫助醫(yī)護(hù)工作者對(duì)結(jié)腸癌微轉(zhuǎn)移的監(jiān)測(cè)[6]。但是門靜脈血是回流肝臟的腸道血液的一條必經(jīng)之路，理論上認(rèn)為結(jié)腸癌微轉(zhuǎn)移會(huì)率先在門靜脈血中發(fā)生，所以相比于外周血的檢測(cè)，對(duì)手術(shù)中抽取門靜脈血，進(jìn)行CK19mRNA表達(dá)的檢測(cè)更加具有實(shí)際的價(jià)值意義[7]。目前CK19mRNA是研究較多的CK分子之一，在惡性上皮組織腫瘤中表達(dá)較高，但是在外周血及非上皮細(xì)胞內(nèi)卻無(wú)表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)擬檢測(cè)CK19基因轉(zhuǎn)錄水平，探討其在結(jié)腸癌中的臨床意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CK19mRNA在結(jié)腸癌患者中的陽(yáng)性表達(dá)率為48.0%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于結(jié)腸息肉患者和健康人的水平，提示CK19mRNA與結(jié)腸癌有著一定的相關(guān)性。研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)CK19mRNA的陽(yáng)性表達(dá)情況與結(jié)腸癌組織的Dukes分期、分化程度及腫瘤轉(zhuǎn)移情況均存在著一定的關(guān)聯(lián)性，說(shuō)明CK19表達(dá)情況的檢測(cè)在腫瘤的分期、分化、轉(zhuǎn)移中均有著重要的意義[8]。而針對(duì)CK19mRNA對(duì)于結(jié)腸癌的診斷價(jià)值，作者將其與CEA和CA199進(jìn)行了比較，CK19mRNA對(duì)于結(jié)腸癌的診斷價(jià)值行ROC曲線分析，結(jié)果提示其敏感性和特異性均顯著優(yōu)于CEA和CA199，提示CK19mRNA其可以作為結(jié)腸癌診斷的一項(xiàng)新腫瘤標(biāo)志物[9]。還有研究表明，CK19mRNA可以作為結(jié)腸癌患者外周血中發(fā)生微轉(zhuǎn)移情況的一個(gè)良好的指標(biāo)；同時(shí)對(duì)CK19mRNA的檢測(cè)還能幫助醫(yī)護(hù)工作者識(shí)別出具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移傾向或復(fù)發(fā)的高危結(jié)腸癌患者，同時(shí)對(duì)結(jié)腸癌患者術(shù)后的化療具有指導(dǎo)性的作用[10]。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CK19mRNA在結(jié)腸癌中的表達(dá)顯著升高，且其表達(dá)水平與腫瘤的分期、分級(jí)及轉(zhuǎn)移有著重要的相關(guān)性，其對(duì)于結(jié)腸癌的診斷價(jià)值優(yōu)于CEA和CA199。

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