董志淵，楊麗英，王馨，李林玉，楊斌，馬維思，嚴(yán)世武，李紹平

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南昆明650200)

燈盞細(xì)辛(Erigeronbreviscapus)為菊科(Compositae)飛蓬屬多年生草本植物，又名燈盞花。以全草入藥，是云南重要的藥用植物和道地藥材，被云南省列為重點(diǎn)發(fā)展的五大系列藥品之一[1]。

燈盞細(xì)辛主要有效成分為黃酮類化合物燈盞乙素，其具有擴(kuò)張腦血管，增加腦血流量，改善微循環(huán)作用，可用于治療缺血性腦血管疾病[2]。

燈盞細(xì)辛主要通過異花授粉[3]進(jìn)行種子繁殖[4]，種質(zhì)保存和品種選育難度較大。采用植物離體組織快繁技術(shù)，可對燈盞細(xì)辛優(yōu)良單株進(jìn)行保存和擴(kuò)繁，獲得基因型一致的無性系群體，對育種工作具有重要意義。本研究主要采用燈盞細(xì)辛基生葉片為外植體，開展不同培養(yǎng)基配方對燈盞細(xì)辛離體培養(yǎng)過程中愈傷組織、不定芽形成，壯苗培養(yǎng)和離體植株生根等方面的影響，進(jìn)一步優(yōu)化燈盞細(xì)辛離體再生植株的技術(shù)方法，為燈盞細(xì)辛種質(zhì)資源保存和育種應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

燈盞細(xì)辛(Erigeronbreviscapus)植株。

1.2 方法

1.2.1 接種

取生長正常健康的葉片，超菌工作臺上用70%的乙醇浸泡30s，2.00%NaOCl消毒約8min，無菌水清洗3次，切成寬約0.50cm的方塊，接種到不同激素配比的MS培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生；培養(yǎng)20d后切取誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織，接種到不同激素配比的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生；培養(yǎng)30d后，將產(chǎn)生不定芽的愈傷組織轉(zhuǎn)接入壯苗培養(yǎng)基中，促進(jìn)不定芽的生長；壯苗培養(yǎng)約60d后，植株高1～3cm，具4～8片葉片時，轉(zhuǎn)入不同激素配比的生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)植株形成根系。

愈傷組織誘導(dǎo)率、不定芽誘導(dǎo)率和不定芽誘導(dǎo)系數(shù)的計(jì)算公式如下：

愈傷組織誘導(dǎo)率 = 產(chǎn)生愈傷組織葉片數(shù) / 葉片總數(shù)

不定芽誘導(dǎo)率 = 產(chǎn)生不定芽的愈傷組織數(shù) / 愈傷組織總數(shù)

不定芽誘導(dǎo)系數(shù) = 不定芽總個數(shù) / 愈傷組織總數(shù)

1.2.2 培養(yǎng)基配制

基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，添加不同濃度的激素2，4-D (2，4-二氯苯氧乙酸)、BA (6-芐基腺嘌呤)、IBA (吲哚丁酸)、NAA (萘乙酸)、KT (激動素)、GA(赤霉素)，附加物水解酪蛋白、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、活性炭，3.00%蔗糖，0.60%瓊脂，pH值5.80～6.00，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2.3 不定芽發(fā)生顯微觀察

以經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽誘導(dǎo)和壯苗培養(yǎng)的愈傷組織塊為材料，采用FAA固定液進(jìn)行固定，常規(guī)石蠟切片法切片，切片厚度10μm，鐵礬-蘇木精染色，脫水透明后在Phenix PH100顯微鏡下觀察不定芽發(fā)生過程，并用MICRO IMAGE MC-D310U(E)顯微攝影裝置進(jìn)行攝影。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)

研究結(jié)果表明，采用MS + BA 1.00mg/L + NAA (0.50 mg/L 或 0.25 mg/L)培養(yǎng)基，愈傷組織外部顏色為綠色，顆粒大，質(zhì)地疏松，愈傷組織生長量較多；MS + BA 1.00mg/L + 2,4-D (0.50mg/L或0.25 mg/L)，愈傷組織為嫩綠色，顆粒狀小且緊密，愈傷組織生長量較少。上述4個培養(yǎng)基配方的愈傷組織誘導(dǎo)率均較高(89.36%～99.22%)，其中MS + BA 1.00mg/L + NAA 0.50 mg/L 培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最高，達(dá)到99.22%(表1)。

表1 不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 不定芽誘導(dǎo)

不同濃度的細(xì)胞分裂素BA對燈盞細(xì)辛不定芽誘導(dǎo)影響較大。較高濃度的細(xì)胞分裂素有利不定芽的形成，其中BA濃度為5.00mg/L，NAA濃度為1.00mg/L時，不定芽誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)系數(shù)均較高，分別為30.84%和0.49(表2)。

表2 不同濃度的細(xì)胞分裂素BA對燈盞細(xì)辛不定芽誘導(dǎo)的影響

細(xì)胞分裂素BA、KT與生長素NAA、IBA不同激素配比的培養(yǎng)基對不定芽誘導(dǎo)影響明顯，其中MS + KT 4.00mg/L + IBA 0.50mg/L培養(yǎng)基有利不定芽的形成，不定芽芽誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)系數(shù)均較高，分別為38.51%和0.49(表3)。

表3 不同激素配比對燈盞細(xì)辛不定芽誘導(dǎo)的影響

2.3 壯苗培養(yǎng)

在MS + BA 0.50mg/L + NAA 0.50 mg/L+水解酪蛋白1000.00 mg/L +PVP 1000.00 mg/L培養(yǎng)基中分別加入GA 0.00mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L，培養(yǎng)誘導(dǎo)獲得的不定芽。結(jié)果表明，GA 0.00mg/L時，不定芽在該培養(yǎng)基上能夠繼續(xù)生長，未發(fā)生明顯褐化現(xiàn)象，但生長較緩慢；添加赤霉素0.50mg/L時，不定芽生長較快，離體植株形態(tài)建成較好，部分發(fā)生玻璃花現(xiàn)象，添加1.00 mg/L的培養(yǎng)基中不定芽生長最快，離體植株形態(tài)建成較好，但玻璃花現(xiàn)象較嚴(yán)重(圖4：1)。

采用經(jīng)過MS + BA 1.00mg/L + NAA 0.50 mg/L、MS + BA5.00mg/L + NAA1.00mg/L和MS + BA 0.50mg/L + NAA 0.50 mg/L+水解酪蛋白1000.00 mg/L +PVP1000.00 mg/L培養(yǎng)的愈傷組織塊，進(jìn)行石蠟切片和顯微觀察。結(jié)果表明，通過不定芽培養(yǎng)，在愈傷組織塊的表層下或表層的部分細(xì)胞染色較深，細(xì)胞質(zhì)濃密，細(xì)胞核明顯，形成分生組織，并發(fā)育形成不定芽原基(圖3：1～2)；通過壯苗培養(yǎng)，不定芽原基進(jìn)一步分化，形成芽的明顯結(jié)構(gòu)(圖3：3～4)。

圖3 愈傷組織不定芽形成

2.4 生根培養(yǎng)

表4 不同激素配比對燈盞細(xì)辛離體植株生根的影響

1/2MS + BA 0.25mg/L + NAA 2.00 mg/L + 活性炭0.30%、1/2MS + BA 0.25mg/L + IBA 2.00 mg/L + 活性炭0.30%等含較低濃度生長素的培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)離體植株生根；1/2MS + BA 0.50mg/L + NAA 2.00 mg/L + IBA 2.00 mg/L + 活性炭0.30%、1/2MS + BA 0.50mg/L + NAA 3.00 mg/L + IBA 3.00 mg/L + 活性炭0.30%等含較高濃度生長素的培養(yǎng)基可誘導(dǎo)離體植株生根(表4；圖4：2)。

圖4 燈盞細(xì)辛離體葉片再生植株

3 討論

燈盞細(xì)辛組織培養(yǎng)中采用的外植體主要有花葶、花盤、葉片、葉柄等[5-6]。其中，葉片易獲得，數(shù)量多，是燈盞細(xì)辛組織培養(yǎng)較好的外植體來源。目前，以葉片為外植體，通過愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)等步驟組成的燈盞細(xì)辛組織培養(yǎng)技術(shù)方法已初步形成。但不同研究者關(guān)于燈盞細(xì)辛組織培養(yǎng)中激素配比使用，及其對培養(yǎng)效果影響報(bào)道差異較大。

林麗飛等[7]采用KT、NAA和2,4-D配比的MS 培養(yǎng)基誘導(dǎo)燈盞細(xì)辛愈傷組織產(chǎn)生，其中KT 0.5 mg/L + 2,4-D 10 mg/L、MS + 2,4-D 0.5 mg/L + 6 -BA 0.5 mg/L 等培養(yǎng)基配方均能高效誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生。馬玉芳等[5]采用MS + 6-BA 1mg/ L + NAA 0.5mg/L培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，培養(yǎng)60d后才開始形成愈傷組織。本研究發(fā)現(xiàn)較低濃度激素BA、NAA和2,4-D配比的MS培養(yǎng)基可較好的誘導(dǎo)葉片愈傷組織產(chǎn)生，培養(yǎng)20d后大部分葉片可產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)到89.36%以上。

關(guān)于燈盞細(xì)辛不定芽誘導(dǎo)，林麗飛等[7]采用MS +6-BA 0.5 mg/L +IBA (0、0.1、0.3、0.5 mg/L) + 10%香蕉汁的培養(yǎng)基可產(chǎn)生一定數(shù)量的不定芽；吳毅歆等[8]采用MS、MS+6-BA0.5 mg/L +NAA0.1 mg/L等較低激素配比培養(yǎng)基，不定芽誘導(dǎo)率均達(dá)到100%；黃衡宇等[6]研究表明不定芽誘導(dǎo)的適宜激素配比是BA 2.0 mg/L +IAA 1.0 m g/L 或 KT 3.0 mg/L +IAA 0.5 mg/L。本研究發(fā)現(xiàn)燈盞細(xì)辛愈傷組織不定芽誘導(dǎo)較困難，采用較高濃度的細(xì)胞分裂素，才能誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生，MS + BA 5.00mg/L + NAA 1.00mg/L培養(yǎng)基不定芽誘導(dǎo)率為30.84%；不同激素配比對不定芽的誘導(dǎo)影響明顯，其中MS + KT 4.00mg/L + IBA 0.50mg/L培養(yǎng)基有利不定芽的形成，不定芽誘導(dǎo)率為38.51%。本研究還發(fā)現(xiàn)，愈傷組織誘導(dǎo)形成的不定芽呈芽點(diǎn)狀，在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上較難繼續(xù)分化生長形成離體植株，并且容易發(fā)生褐化現(xiàn)象。因此本研究將誘導(dǎo)形成的不定芽轉(zhuǎn)接入含不同濃度赤霉素的MS + BA 0.50mg/L + NAA 0.5 mg/L+水解酪蛋白1000 mg/L +PVP1000 mg/L培養(yǎng)基，防止褐化，促進(jìn)不定芽的生長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過壯苗培養(yǎng)，特別是添加低濃度的赤霉素，不定芽生長明顯。

本研究還發(fā)現(xiàn)，燈盞花離體植株生根也需較高濃度生長素，如1/2MS + BA 0.50mg/L+NAA 2.00 mg/L + IBA 2.00 mg/L+活性炭0.30%、1/2MS+BA 0.50mg/L+NAA 3.00 mg/L+IBA 3.00 mg/L+活性炭0.30%等配方。含較高濃度生長素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)燈盞細(xì)辛離體植株生根效果較好。該結(jié)果與黃衡宇等[7]、吳毅歆等[8]，關(guān)于燈盞細(xì)辛離體植株生根適宜培養(yǎng)基配方差別較大，還有待進(jìn)一步研究。

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