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(天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300350)

灰樹花是擔子菌亞門，多孔菌目，多孔菌科，樹花屬中的一種大型真菌，又名貝葉多孔菌、栗子蘑、佛菌等，是一種食、藥兼用的珍稀食用菌。國內(nèi)外大量灰樹花藥理藥學(xué)科學(xué)研究證明，灰樹花胞內(nèi)胞外多糖具有顯著的降血糖、抗腫瘤、抗HIV病毒、抗肝炎以及改善免疫系統(tǒng)功能等功效。而在降血脂方面只有袁德云等曾對其水溶性多糖進行過研究。本文對灰樹花菌絲體進行了提取水溶性多糖進行小鼠的降血脂實驗研究。

1材料與方法

1.1 材料

昆明種雄性健康小鼠,體重20 g左右；灰樹花菌絲體干粉；高脂飼料(以質(zhì)量分數(shù)計):小鼠基礎(chǔ)飼料添加 1% 膽固醇、0% 蛋黃粉、0.2% 膽酸鹽、10% 豬油、15% 蔗糖。

葡聚糖凝膠 Sephadex G200，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司；總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇試劑、高密度脂蛋白膽固醇，中生北控生物科技股份有限公司。

SP-2102PC分光光度計，上海光譜儀器有限公司；酶標儀(Fcc)。

1.2 方法

1.2.1 灰樹花菌絲體多糖制備

取灰樹花菌絲體干粉加蒸餾水，至菌絲體的質(zhì)量分數(shù)為 60%，在冰水浴下超聲波破壁 10 min，然后加水稀釋到質(zhì)量分數(shù)為 4%，水浴 6 h，80 ℃。上清液加3倍體積95%乙醇，12h，4℃。離心得到沉淀物Sevage法去蛋白，大孔樹脂吸附超濾，冷凍干燥得到白色絮狀物質(zhì)水溶性多糖(灰樹花菌絲體多糖) 。將樣品(灰樹花菌絲體) 配制成10 mg/mL 溶液，微孔過濾后上Sephadex G200柱層析(2×35)，超純水洗脫，流速0.3 mL/min，1.5 mL/管分部收集，苯酚-硫酸法檢測菌絲體多糖含量。

苯酚硫酸法的測定原理：利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，再以比色法測定。已糖在490 nm處有最大吸收，吸收值與含量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

葡萄糖標準曲線制備：

葡萄糖溶液濃度為0.1%，按下表1-1配標準曲線待測液，添加順序為先在試管中加葡萄糖溶液，再添加蒸餾水，5%苯酚，最后添加濃硫酸。在100℃水浴鍋加熱20分鐘，冷卻，利用分光光度計在490 nm處測定吸光度，根據(jù)葡萄糖濃度和對應(yīng)吸光度繪出標準曲線(圖1-1)，計算其標準曲線回歸方程：Y=88.998x-0.4815(R2=0.999，n=7)

表1-1 葡萄糖標準曲線檢測液配比

圖1-1 葡萄糖標準曲線圖

1.2.2 降血脂實驗

高血脂動物模型的建立及實驗分組：將30只小白鼠隨機分為5組，每組6只，這5組分別是陰性對照組、高脂對照組、高劑量給藥組、中劑量給藥組、低劑量給藥組。陰性對照組用普通飼料喂養(yǎng)，高脂對照組、高劑量給藥組、中劑量給藥組、低劑量給藥組用高脂飼料喂養(yǎng)，經(jīng)過14天的有效喂養(yǎng)后分析各組別小鼠血樣，確定高血脂建模成功。接下來高脂對照組、高劑量給藥組、中劑量給藥組、低劑量給藥組繼續(xù)用高脂飼料，陰性對照組用普通飼料喂養(yǎng)。同時高劑量給藥組、中劑量給藥組、低劑量給藥組，利用不同劑量的灰樹花菌絲體多糖灌胃，高脂對照組、陰性對照組用生理鹽水灌胃，見表1-1。再經(jīng)過14 天后摘小鼠眼球取血,測定小鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。采用組間t檢驗法。

表 1-1 實驗設(shè)計方案

2結(jié)果與分析

2.1 純度鑒定

柱層析分析：葡聚糖凝膠層析，是使待分離物質(zhì)通過葡聚糖凝膠層析柱，各個組分由于分子量不相同，在凝膠柱上受到的阻滯作用不同，而在層析柱中以不同的速度移動。分子量大的先流出來，分子量小的后流出來，最終可以分離出不同分子量的化學(xué)組分。葡聚糖凝聚層析具有穩(wěn)定性好、吸附性小等優(yōu)點。SephadexG200的分離范圍5-60kDa。從圖2-1可以看出，灰樹花菌絲體多糖是一種分子量均一組分。

2.2 降血脂實驗測定結(jié)果

如表2-1，灰樹花菌絲體多糖 在中、高劑量給藥下,具有較顯著的調(diào)節(jié)小鼠血脂代謝的作用。高血脂癥小鼠總膽固醇 (TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)的指標明顯降低，隨著菌絲體多糖劑量的增加，高血脂癥小鼠的總膽固醇 (TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)的指標降低越明顯。中劑量組中小鼠血清中總膽固醇(TC)與高脂對照組相比降低28.2%、甘油三脂(TG) 高脂對照組相比降低30.8%、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C) 與高脂對照組相比53.0%，具有明顯降低作用。中劑量組HDL-C/TC 值與高脂對照組相比升高9.9%，高劑量組HDL-C/TC 值與高脂對照組相比升高45.5%,都有顯著升高作用。雖然高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)變化不大，但是HDL-C：TC隨著劑量的增加而增大，這個比值越大說明它的抗動脈能力越強。其中中劑量組(50 mg/kg·d)血脂各項指標最接近陰性對照組。

圖3-6 菌絲體多糖Sephadex G200凝膠過濾圖譜

組別cTC/(mmol L-1)cTG/ (mmol L-1)cHDL-C/ (mmol L-1)cLDL-C/ (mmol L-1)cHDL-C:cTC陰性對照4.28±0.341.87±0.211.63±0.211.65±0.140.376±0.011高脂對照8.13±0.942.66±0.332.45±0.143.13±0.230.312±0.034低劑量組7.54±0.652.66±0.242.24±0.322.23±0.40*0.311±0.023中劑量組5.84±0.82*1.84±0.45*2.21±0.331.47±0.19***0.343±0.065*高劑量組4.24±0.74**1.30±0.34***2.03±0.211.05±0.17***0.454±0.053**

注: 低、中、高劑量組：(25、50、100 mg/(kg·d)) 與陽性對照比較*P< 0. 05 ,**P< 0. 01***P< 0. 001.

3討論

灰樹花菌絲體多糖經(jīng)過提取純化，通過Sephadex G200凝膠柱層析，鑒定認為灰樹花菌絲體多糖為均一組分。

灰樹花菌絲體多糖之所以能調(diào)節(jié)血脂可能是由于多糖能夠在加快肝膽循環(huán)，有效增強機體的免疫機制，使肝內(nèi)生存的酮體和肝外組織所能利用的限度達到很好的一個平衡，從而降低了血脂在血液中的堆積。最終達到一種降血脂的作用。

參考文獻：

[1]Kawagishi H, Nomura A, Mizuno T, et al. Isolation and characterization of a lectin from Grifola frondosa fruiting bodied[J]. Biochimica Et Biophysica Acta, 1990, 1034: 247-252.

[2]Suzuki I, Itani T, Ohno N, et al. Antitumor-activity of a polysaccharide fraction extracted from cultured fruiting bodied of Grifola frondosa[J]. Journal of Pharmacobio-dynam ,1984, 7: 492-500.

[3]Smith J E, Rowan N J, Sullivan R. Medicinal mushrooms: a rapidly developing area of biotechnology for cancer therapy and other bioactivities[J]. Biotechnology Letters, 2002, 24: 1839-1845.

[4]袁德云,章克昌.灰樹花發(fā)酵液及其胞內(nèi)純化物的降血脂作用[J].中國藥學(xué)雜志,2003,(07).