沈兆兵, 劉曉潔, 劉 莉, 史吉平

1.中國科學(xué)院上海高等研究院, 上海 201210；

2.車用生物燃料技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 南陽 473000；

3.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049

丁醇是一種重要的C4平臺(tái)化合物，主要用于鄰苯二甲酸正丁酯、磷酸丁酯、丙烯酸丁酯及醋酸丁酯等的合成，還可用作油脂、醫(yī)藥和香料的提取溶劑以及醇酸樹脂的添加劑等。隨著生物質(zhì)能源的多元化發(fā)展，近年來的研究表明，丁醇也是一種優(yōu)質(zhì)燃料和燃料添加劑。其高沸點(diǎn)(118℃)和低蒸汽壓有助于汽車的冷啟動(dòng)；由于丁醇的疏水性比乙醇更強(qiáng)，因此更易于與汽、柴油烴類燃料相混溶；而丁醇的完全燃燒性，可大大降低尾氣的CO2排放，且不發(fā)生殘留烴污染，對(duì)凈化空氣十分有利。上述優(yōu)點(diǎn)可使丁醇成為未來發(fā)動(dòng)機(jī)新型綠色燃料，替代礦化燃料的新型液體燃料之一[1]。2007年上半年，杜邦公司和BP公司宣布聯(lián)手開發(fā)新一代生物燃料——丁醇，這預(yù)示著丁醇在未來的運(yùn)輸燃料結(jié)構(gòu)中將會(huì)占有重要的比重。

在二戰(zhàn)時(shí)期，丙酮-丁醇-乙醇(acetone-butanol-ethanol，以下簡稱ABE)主要是利用糧食發(fā)酵生產(chǎn)，所用原料主要是玉米、糖蜜以及玉米和高粱、紅薯等的混合物。所用菌種主要是產(chǎn)溶劑梭菌，按ABE產(chǎn)品比例不同分為3∶6∶1傳統(tǒng)梭菌和2∶7∶1高丁醇比梭菌，所得溶劑總量約20 g/L[2]。發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇一直持續(xù)到20世紀(jì)80年代末90年代初，此后因受到石油制品的競爭擠壓和發(fā)酵原料農(nóng)副產(chǎn)品價(jià)格上升因素的影響，發(fā)酵法制造丁醇技術(shù)逐步退出商業(yè)性生產(chǎn)。但石油畢竟是一種礦化原料，不可再生且礦藏量有限，后石油時(shí)代遲早會(huì)到來。21世紀(jì)全球面臨的難題之一，是如何解決石油的短缺，據(jù)2003年預(yù)測，按照目前已探明的世界石油儲(chǔ)量和開采速度，全球石油的平穩(wěn)供應(yīng)只能維持40年左右。盡管各界對(duì)石油枯竭的預(yù)測數(shù)字一直存有爭議，全球石油資源正在日趨減少則是不爭的事實(shí)。隨著石油價(jià)格的不斷上漲及其對(duì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的沖擊，加快生物質(zhì)能源和不依賴石油基化學(xué)品生產(chǎn)方法的研究開發(fā)已成為日益緊迫的課題。因此，發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇技術(shù)作為一種重要的技術(shù)儲(chǔ)備重新引起了廣泛的關(guān)注[3]。

以糧食為底物的丁醇發(fā)酵面臨的最大問題是較高的糧食價(jià)格致使原料成本占ABE生產(chǎn)總成本的比例偏高(約60%)，這不僅限制了丁醇產(chǎn)品的市場競爭力，也有悖于我國的糧食安全戰(zhàn)略。因此國家發(fā)改委已于2007年底暫停了利用糧食生產(chǎn)生物能源項(xiàng)目的備案及核準(zhǔn)，鼓勵(lì)發(fā)展非糧生物質(zhì)能源。因此，以廉價(jià)的生物質(zhì)資源作為發(fā)酵原料生產(chǎn)丁醇是今后發(fā)展的必然趨勢[4]。

玉米皮是玉米淀粉加工的副產(chǎn)物，產(chǎn)量一般占玉米總量的14%～20%。含有10%～20%的淀粉、30%～50%的半纖維素、10%～20%的纖維素以及少量的蛋白質(zhì)，幾乎不含木質(zhì)素[5]。目前我國玉米皮利用率較低，只有部分應(yīng)用于飼料行業(yè)，附加值比較低，造成了資源的極度浪費(fèi)。從組分含量可以看出玉米皮是一種優(yōu)質(zhì)的可用于生產(chǎn)丁醇的廉價(jià)生物質(zhì)資源[6]。

本文研究了以玉米皮為原料，經(jīng)過稀酸預(yù)處理、酶解和發(fā)酵等步驟，充分利用其中的淀粉和半纖維素水解生成的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的混合糖作為碳源，厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，有效減少了丁醇發(fā)酵對(duì)淀粉類糧食原料的依賴，同時(shí)也降低了原料成本[7]。剩余的纖維素還可用來制備附加值更高的膳食纖維產(chǎn)品，這樣既充分利用了玉米皮原料組分，又降低了丁醇生產(chǎn)的原料成本，為丁醇的發(fā)酵生產(chǎn)提供一個(gè)新的途徑。

1 材料與方法

1.1菌種

本實(shí)驗(yàn)所用的拜氏梭菌ClostridiumbeijerinckiiNCIMB8052，購于美國菌種保藏中心。

1.2實(shí)驗(yàn)原料

玉米皮購于河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司；淀粉酶和半纖維素酶購于白銀賽諾生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3培養(yǎng)基

TYA種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，酵母粉2 g/L，蛋白胨6 g/L，牛肉粉2 g/L，NH4AC 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，K2HPO40.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，115℃滅菌15 min[15]。

水解液發(fā)酵培養(yǎng)基：脫毒后的水解液調(diào)節(jié)pH 6.8，115℃滅菌15 min。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1玉米皮預(yù)處理 將玉米皮與不同濃度的稀硫酸溶液按照固液比1∶8均勻混合，放入不銹鋼預(yù)處理管式反應(yīng)器中，密封。將反應(yīng)器放入設(shè)定好溫度的油浴鍋中，控制油浴溫度為120～160℃，反應(yīng)時(shí)間為20 min。反應(yīng)結(jié)束后，立刻從油浴中取出反應(yīng)器置于冷水中冷卻以終止反應(yīng)[13]。

1.4.2酶解 將預(yù)處理料液轉(zhuǎn)入三角瓶中，調(diào)節(jié)pH 5.0，加入一定量的糖化酶和木聚糖酶，50℃搖床150 r/min酶解48 h，固液分離，濾液用于水解液脫毒[14]。同時(shí)取濾液過0.22 μm膜，HPLC檢測液體中水解產(chǎn)生的可發(fā)酵糖的濃度。

1.4.3水解液脫毒 酶解液固液分離后的濾液加一定量的活性炭，50℃搖床150 r/min脫毒2 h。固液分離，液體用于配制丁醇發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.4.4丁醇發(fā)酵 將0.5 mL冷凍保藏的菌種接種于含有10 mL TYA種子培養(yǎng)基的試管中，沸水浴中熱激1 min，迅速放入冷水中使之冷卻，37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，得到一級(jí)種子。然后按10%的接種量將一級(jí)種子轉(zhuǎn)入含有40 mL種子培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h用于發(fā)酵接種[15]。將活化好的菌種按體積比5%的接種量接種于250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃靜置培養(yǎng)，自然pH[15]。

1.5分析方法

1.5.1玉米皮組分測定 玉米皮中葡聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖和木質(zhì)素的測定方法參考NREL LAP[8]；淀粉的測定采用酸水解法[9]；蛋白質(zhì)的測定采用凱氏定氮法[10]；灰分的測定參考NREL LAP[11]；脂肪的測定采用索氏提取法[12]。

1.5.2發(fā)酵液溶劑的測定 取不同時(shí)間的發(fā)酵液1 mL，10 000 r/min離心5 min，上清液用氣相色譜儀(Shimadzu，GC-2010 Plus)測定發(fā)酵溶劑丙酮、丁醇和乙醇的含量。色譜條件為：毛細(xì)管色譜柱InertCap Pure Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫：50℃保持3.8 min，以20℃/min升至220℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度200℃，F(xiàn)ID檢測器溫度230℃；載氣N2流量1 mL/min，H2流量40 mL/min；空氣流量400 mL/min；進(jìn)樣量0.5 μL，分流比50∶1。采用內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)為異丁醇[16]。

1.5.3發(fā)酵液殘?zhí)堑臏y定 取不同時(shí)間的發(fā)酵液1 mL，10 000 r/min離心5 min，上清液用0.22 μm的膜過濾，液相色譜儀(Shimadzu，LC-20A)測定發(fā)酵液中殘留的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纖維二糖含量。色譜條件為：色譜柱Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)，柱溫65℃，流動(dòng)相0.005 mol/L H2SO4，流速0.8 mL/min，檢測器為RID，進(jìn)樣量20 μL。采用外標(biāo)法定量[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1玉米皮組分分析

玉米皮原料的全組分分析結(jié)果見表1，從數(shù)據(jù)中可以看出，玉米加工副產(chǎn)物玉米皮中可用于丁醇發(fā)酵碳源的組分有四類，按照可利用程度由易到難排序?yàn)椋旱矸?木聚糖=阿拉伯聚糖<纖維素。以玉米皮為原料發(fā)酵丁醇有三種方案：①利用淀粉酶分泌能力較強(qiáng)的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)以淀粉為碳源，直接發(fā)酵生產(chǎn)丁醇。但由于玉米皮中淀粉含量僅為15.8%，直接發(fā)酵時(shí)終產(chǎn)物產(chǎn)量低，后期溶劑提取蒸餾成本太高；②對(duì)玉米皮進(jìn)行部分水解預(yù)處理，使其中較容易降解的淀粉和半纖維素(即木聚糖和阿拉伯聚糖)轉(zhuǎn)化成單糖，利用拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)以水解產(chǎn)生的單糖為碳源發(fā)酵丁醇，初始單糖濃度約45～55 g/L，正好與拜氏梭菌最適初糖濃度50 g/L相一致；③對(duì)玉米皮進(jìn)行完全水解預(yù)處理，使其中的淀粉、纖維素和半纖維素全部水解轉(zhuǎn)化成單糖，利用拜氏梭菌以水解產(chǎn)生的單糖為碳源發(fā)酵丁醇，該方案一方面由于預(yù)處理強(qiáng)度大，會(huì)產(chǎn)生更多的發(fā)酵抑制物，導(dǎo)致菌株不能正常發(fā)酵，另一方面水解產(chǎn)生的單糖濃度約60～90 g/L，底物濃度過高不僅造成糖資源浪費(fèi)，而且還存在底物抑制。因此，本文采用方案②對(duì)玉米皮進(jìn)行發(fā)酵研究，值得一提的是，玉米皮組分中還含有11.5%的蛋白質(zhì)，其在預(yù)處理階段可部分降解提供菌體發(fā)酵所需氮源。經(jīng)過預(yù)處理和酶解兩步操作之后原料中的淀粉、木聚糖、阿拉伯聚糖和蛋白質(zhì)基本已被除去，剩余的玉米皮殘?jiān)饕抢w維素，由于原料中木質(zhì)素(3.1%)和灰分(1.0%)含量極低，因此剩余殘?jiān)禽^好的膳食纖維來源。

表1 玉米皮組分分析

2.2稀酸預(yù)處理對(duì)總糖得率的影響

由于玉米皮具有復(fù)雜的超分子結(jié)構(gòu)和抗降解屏障特性，必須經(jīng)過預(yù)處理才能夠使其中的半纖維素和淀粉降解為可發(fā)酵糖。本研究采用預(yù)處理的目的是使淀粉液化，半纖維素部分降解，玉米皮原料結(jié)構(gòu)變疏松，使得后續(xù)木聚糖酶與底物能夠充分接觸。影響預(yù)處理效果的因素有溫度、酸濃度、時(shí)間和固液比等，通常溫度和酸濃度是較為重要的兩個(gè)因素，因此本實(shí)驗(yàn)在固液比1∶8，處理時(shí)間20 min條件下，分別考查了溫度120℃～160℃和稀硫酸濃度0.1%～0.9%預(yù)處理對(duì)酶解所得總糖的影響。本研究固定酶解條件為：糖化酶1.0 IU/g底物，木聚糖酶200 IU/g底物。

隨著預(yù)處理溫度從120℃升高至160℃，酶解后的總糖得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，結(jié)果見圖1。當(dāng)溫度為140℃時(shí)，總糖濃度達(dá)到最大值50.46 g/L。低于140℃時(shí)由于預(yù)處理強(qiáng)度較低，總糖得率不能達(dá)到丁醇發(fā)酵初糖的要求。而當(dāng)溫度高于140℃時(shí)，部分已降解的單糖在高溫條件下會(huì)進(jìn)一步發(fā)生脫水反應(yīng)生成糠醛和羥甲基糠醛等發(fā)酵抑制物，影響后續(xù)發(fā)酵的正常進(jìn)行，因此，預(yù)處理不宜選擇較高的溫度，140℃為最優(yōu)條件。

圖1 預(yù)處理溫度對(duì)總糖得率的影響

預(yù)處理過程中稀硫酸濃度對(duì)酶解后總糖得率的影響見圖2。當(dāng)稀硫酸濃度從0.1%升高至0.5%時(shí)，總糖濃度不斷上升。當(dāng)硫酸濃度為0.5%時(shí)，總糖濃度為50.46 g/L。隨著硫酸濃度繼續(xù)升高至0.7%，總糖濃度基本保持不變，為50.65 g/L。0.9%的硫酸濃度則會(huì)導(dǎo)致單糖的進(jìn)一步降解。因此最佳的預(yù)處理硫酸濃度為0.5%。

圖2 預(yù)處理硫酸濃度對(duì)總糖得率的影響

2.3酶解對(duì)總糖得率的影響

預(yù)處理過程中淀粉已被液化，但未全部糖化為葡萄糖；半纖維素也發(fā)生部分降解，水解生成木糖、阿拉伯糖等單糖。為了使淀粉和半纖維素組分充分降解為單糖，需要在預(yù)處理后加入糖化酶和木聚糖酶進(jìn)行酶解，以得到更多的單糖。木聚糖酶的底物專一性并不強(qiáng)，除了能水解木糖殘基外，還能水解阿拉伯糖殘基，從而生成木糖和阿拉伯糖這兩種五碳糖。

糖化酶的用量對(duì)淀粉水解的影響見圖3。當(dāng)糖化酶用量從100 IU/g底物升高至300 IU/g底物時(shí)，淀粉水解生成的葡萄糖量逐漸增大，200 IU/g底物的酶用量對(duì)應(yīng)葡萄糖濃度為16.33 g/L，隨后糖化酶用量繼續(xù)增加至250 IU/g底物和300 IU/g底物時(shí)，葡萄糖濃度基本保持不變。從酶的成本和經(jīng)濟(jì)性角度考慮，200 IU/g底物的糖化酶用量為最佳值。

木聚糖酶的用量對(duì)半纖維素水解生成木糖和阿拉伯糖的影響見圖4。當(dāng)木聚糖酶用量從0.6 IU/g底物升高至1.4 IU/g底物時(shí)，所得的木糖和阿拉伯糖總和逐漸升高，但當(dāng)酶用量大于1.0 IU/g底物時(shí)，木糖和阿拉伯糖的增加并不明顯，因此1.0 IU/g底物是最優(yōu)的木聚糖酶添加量，此時(shí)酶解液中木糖含量為13.45 g/L，阿拉伯糖含量為13.3 g/L。

圖3 糖化酶用量對(duì)淀粉水解的影響

在最優(yōu)的酶解條件(糖化酶200 IU/g底物，木聚糖酶1.0 IU/g底物)下，玉米皮酶解液中可發(fā)酵糖的組成見表2。除了來自淀粉水解產(chǎn)生的葡萄糖、半纖維素水解產(chǎn)生的木糖和阿拉伯糖之外，還存在一定量的纖維二糖(4.76 g/L)，來自于少量易降解的無定形纖維素的水解。玉米皮酶解液中總糖含量達(dá)到50.46 g/L，達(dá)到丁醇發(fā)酵所需的初始糖濃度。

圖4 木聚糖酶用量對(duì)半纖維素水解的影響

表2 玉米皮酶解液中可發(fā)酵糖組成

2.4水解液脫毒對(duì)丁醇發(fā)酵的影響

玉米皮在高溫酸性預(yù)處理過程中，會(huì)產(chǎn)生三大類發(fā)酵抑制物，包括有機(jī)酸(乙酸、甲酸)、呋喃類物質(zhì)(糠醛、羥甲基糠醛)和木質(zhì)素單體，這些物質(zhì)的存在會(huì)影響微生物的生長及其代謝產(chǎn)生丁醇。發(fā)酵抑制物的含量與預(yù)處理強(qiáng)度參數(shù)有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中玉米皮的預(yù)處理采用的溫度和酸濃度都較低，因此發(fā)酵抑制物種類和含量并不多，只需要經(jīng)過簡單的活性炭脫毒就可以實(shí)現(xiàn)丁醇發(fā)酵，圖5顯示了經(jīng)不同程度的活性炭脫毒后丁醇發(fā)酵產(chǎn)總?cè)軇┑那闆r，TYA對(duì)照培養(yǎng)基的發(fā)酵總?cè)軇┊a(chǎn)量可達(dá)13.85 g/L，而未經(jīng)脫毒的水解液直接用于丁醇發(fā)酵，總?cè)軇┊a(chǎn)量僅為6.99 g/L。當(dāng)用0.5%～2.0%活性炭脫毒后，總?cè)軇┊a(chǎn)量都有顯著提高，其中1.0%活性炭脫毒后，總?cè)軇┊a(chǎn)量為14.09 g/L，此時(shí)丁醇產(chǎn)量為9.72 g/L，繼續(xù)增加活性炭的用量，溶劑產(chǎn)量無明顯提高，因此最佳的活性炭脫毒用量為1.0%。

表3列出了最佳發(fā)酵條件下總?cè)軇┑寐屎偷孜锢玫那闆r，水解液發(fā)酵培養(yǎng)基中共存在4種可發(fā)酵糖作為碳源：纖維二糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。其中葡萄糖基本上可以被完全利用，利用率高達(dá)99.89%；而木糖、阿拉伯糖這兩種五碳糖的利用率明顯較低，只有71.38%和67.89%；纖維二糖是最難被利用的，其利用率僅為55.25%。發(fā)酵總?cè)軇┊a(chǎn)量為14.09 g/L，計(jì)算得到的糖醇轉(zhuǎn)化率為35.1%(W/W)。

圖5 活性炭脫毒對(duì)玉米皮水解液發(fā)酵產(chǎn)丁醇的影響

表3 脫毒水解液丁醇發(fā)酵結(jié)果

3 討論

玉米皮作為玉米淀粉加工副產(chǎn)物，含有豐富的淀粉、半纖維素和纖維素等組分，是一種潛在的優(yōu)質(zhì)生物質(zhì)資源。但目前對(duì)玉米皮的利用僅限于加工飼料，且用量有限，造成了資源的極大浪費(fèi)。本研究從玉米皮全組分分析入手，以組分最大化、高值化利用為目標(biāo)，考察了利用淀粉和半纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)液體燃料丁醇的工藝技術(shù)。由于玉米皮的抗降解屏障結(jié)構(gòu)，首先必須經(jīng)過預(yù)處理才能夠使其中的淀粉和半纖維素降解為可發(fā)酵糖，本研究采用稀硫酸預(yù)處理，主要作用有三方面：①保證淀粉充分液化；②半纖維素部分降解；③玉米皮原料結(jié)構(gòu)疏松，利于后續(xù)酶與底物充分接觸。以酶解后產(chǎn)生的總糖得率為指標(biāo)，確定了稀硫酸預(yù)處理在固定的反應(yīng)時(shí)間20 min和固液比1∶8的條件下，最佳溫度為140℃，酸濃度為0.5%。玉米皮經(jīng)過最優(yōu)條件下的稀硫酸預(yù)處理后，分別加入200 IU/g底物糖化酶、1.0 IU/g底物木聚糖酶對(duì)預(yù)處理料液進(jìn)行深度水解，此時(shí)已液化的淀粉在糖化酶的作用下可全部水解為葡萄糖，絕大部分半纖維素在木聚糖酶的作用下水解產(chǎn)生木糖和阿拉伯糖，由于預(yù)處理強(qiáng)度較低，且酶解過程中沒有添加纖維素酶，大部分纖維素并未水解成葡萄糖，只有少量易降解的無定形結(jié)構(gòu)纖維素發(fā)生水解，因此酶解液中會(huì)出現(xiàn)少量纖維二糖，經(jīng)酶解得到包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纖維二糖在內(nèi)的總糖濃度為50.46 g/L的水解液。由于高溫酸性預(yù)處理會(huì)導(dǎo)致單糖和木質(zhì)素的降解，生成糠醛、木質(zhì)素單體等發(fā)酵抑制物，經(jīng)過1.0%的活性炭脫毒處理可有效去除這些發(fā)酵抑制物，丁醇發(fā)酵總?cè)軇┊a(chǎn)量為14.09 g/L，丁醇產(chǎn)量為9.72 g/L，糖醇轉(zhuǎn)化率為35.1%(W/W)。本研究證實(shí)利用玉米皮發(fā)酵丁醇在技術(shù)上是可行的，研究成果既為玉米皮的綜合利用提供一條新的途徑，同時(shí)也為丁醇發(fā)酵生產(chǎn)尋找到一種新的原料來源。

[1]華連灘, 王義強(qiáng), 彭牡丹, 等. 生物發(fā)酵產(chǎn)丁醇研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2014, 41(1)：146-155.

[2]顧 陽, 蔣 宇, 吳 輝, 等. 生物丁醇制造技術(shù)現(xiàn)狀和展望[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2010, 26(7)：914-923.

[3]Qureshi N, Ezeji T C, Ebener J,etal.. Butanol production byClostridiumbeijerinckii, Part I：Use of acid and enzyme hydrolyzed corn fiber[J]. Bioresour. Technol., 2008, 99：5915-5922.

[4]Du T F, He A Y, Wu H,etal.. Butanol production from acid hydrolyzed corn fiber withClostridiumbeijerinckiimutant[J]. Bioresour. Technol., 2013, 135：254-261.

[5]Javed M M, Zahoor S, Shafaat S,etal.. Wheat bran as a brown gold：Nutritious value and its biotechnological applications[J]. Afr. J. Microbiol. Res., 2012, 6：724-733.

[6]Guo T, He A Y, Du T F,etal.. Butanol production from hemicellulosic hydrolysate of corn fiber by aClostridiumbeijerinckiimutant with high inhibitor-tolerance[J]. Bioresour. Technol., 2013, 135：379-385.

[7]Qureshi N, Li X L, Hughes S,etal.. Butanol production from corn fiber xylan usingClostridiumacetobutylicum[J]. Biotechnol. Progr., 2006, 22：673-680.

[8]Sluiter A, Hames B, Ruiz R,etal.. Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass： Laboratory Analytical Procedure (LAP)[EB/OL]. http：//www.nrel.gov/docs/gen/fy13/42618.pdf, 2012-08-03.

[9]劉 莉, 史吉平, 孫俊松, 等. 丙酮丁醇梭菌發(fā)酵小麥麩皮生產(chǎn)丁醇[J]. 中國釀造, 2012, 31(8)：32-35.

[10]Hames B, Scarlata C, Sluiter A. Determination of Protein Content in Biomass：Laboratory Analytical Procedure (LAP).[EB/OL].http：//www.nrel.gov/docs/gen/fy08/42625.pdf, 2008-05-23.

[11]Sluiter A, Hames B, Ruiz R,etal.. Determination of Ash in Biomass： Laboratory Analytical Procedure (LAP).[EB/OL].http：//www.nrel.gov/docs/gen/fy08/42622.pdf, 2005-07-17.

[12]Sluiter A, Ruiz R, Scarlata C,etal.. Determination of Extractives in Biomass： Laboratory Analytical Procedure (LAP). [EB/OL].http：//www.nrel.gov/docs/gen/fy08/42619.pdf, 2005-07-17.

[13]Liu L, Sun J, Cai C,etal.. Corn stover pretreatment by inorganic salts and its effects on hemicellulose and cellulose degradation[J]. Bioresour. Technol., 2009, 100：5865-5871.

[14]王戰(zhàn)勇, 蘇婷婷, 胡珍珠. 雙酶法制備玉米皮膳食纖維的研究[J]. 氨基酸和生物資源, 2009, 31(1)：37-39.

[15]張麗麗, 沈兆兵, 史吉平, 等. 紫外誘變和丁醇馴化復(fù)合選育高產(chǎn)丁醇菌株[J]. 中國釀造, 2013,32(5)：129-133.

[16]Wang L, Chen H. Acetone-butanol-ethanol fermentation and isoflavone extraction using kudzu roots[J]. Biotechnol. Bioprocess Eng., 2011, 16：739-745.

[17]Cho D H, Shin S J, Sang B I,etal.. ABE production from yellow poplar through alkaline pre-hydrolysis, enzymatic saccharification, and fermentation[J]. Biotechnol. Bioprocess Eng., 2013, 18：965-971.