譚芙蓉， 代立春， 吳 波， 秦 晗， 祝其麗， 王文國(guó)， 湯曉玉， 潘 科，蘇海鋒， 胡啟春，2， 何明雄，2*

1.農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所，生物質(zhì)能技術(shù)研究中心，成都 610041;

2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)村可再生能源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041

隨著能源危機(jī)和石化燃料引起的環(huán)境污染的加劇，世界各國(guó)都在積極探求可以替代化石燃料的能源，生物質(zhì)能源具有可再生性、低污染性、廣泛分布性及資源豐富性，逐漸成為能源替代研究的熱點(diǎn)，發(fā)展前景良好，未來有可能成為可再生能源的主導(dǎo)［1］。生物質(zhì)能是蘊(yùn)藏在生物質(zhì)內(nèi)的能量，直接或間接來源于綠色植物經(jīng)光合作用轉(zhuǎn)化的化學(xué)能，對(duì)生物質(zhì)能的轉(zhuǎn)化利用形式包括生物乙醇、生物制氫、生物柴油、生物質(zhì)氣化及液化燃料等。

能源植物是可直接開發(fā)的最有前景的生物質(zhì)資源之一。我國(guó)幅員遼闊，水熱資源分布多差異，能源植物資源種類豐富多樣，但是我國(guó)對(duì)能源植物的開發(fā)和應(yīng)用起步較晚，與西方發(fā)達(dá)國(guó)家相比還有相當(dāng)大的差距。如果我國(guó)能加強(qiáng)生物能源的研究與開發(fā)，篩選出更多優(yōu)質(zhì)、高效的能源植物，并將其轉(zhuǎn)化為氣體或液體燃料，一方面可以彌補(bǔ)石化燃料的不足，緩解過分依賴大量進(jìn)口石油的被動(dòng)局面，實(shí)現(xiàn)我國(guó)能源安全戰(zhàn)略;另一方面還能發(fā)揮其保持水土和改良土壤的作用，達(dá)到保護(hù)和建設(shè)生態(tài)環(huán)境的目的。進(jìn)一步建立中國(guó)能源植物種質(zhì)資源開發(fā)基地和生物燃油生產(chǎn)技術(shù)體系，對(duì)于培育和利用中國(guó)能源植物資源以及儲(chǔ)備后備能源都具有十分重要的意義。本文從能源植物的概念及分類入手，概述了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在能源植物遺傳改良中取得的進(jìn)展及應(yīng)用現(xiàn)狀，為進(jìn)一步利用該技術(shù)改良能源植物提供參考。

1 能源植物的概念及分類

能源植物是可再生能源開發(fā)的唯一資源對(duì)象，它通過光合作用固定二氧化碳和水，將太陽(yáng)能以化學(xué)能形式儲(chǔ)藏在植物中。廣義的能源植物包括所有的陸地和海洋植物;狹義的能源植物指植物本身(不包括籽粒)含有油脂或石油類似物質(zhì)的植物。能源植物可以直接燃燒產(chǎn)生熱能，還可以轉(zhuǎn)化成固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)燃料。根據(jù)植物的光合途徑分類，能源植物主要是C3和C4植物［2］，目前還沒有屬于景天酸循環(huán)(crassulacean acid metabolism，CAM)類型的能源植物的報(bào)道。根據(jù)植物的生活周期，能源植物分為一年生(如甘薯、高粱、大豆和續(xù)隨子等)、兩年生(如甜菜，這類植物種類較少)和多年生植物三大類［2］，其中多年生能源植物又分為草本(如柳枝稷、芒草和虉草等)和木本(楊樹、柳樹和麻瘋樹等)植物兩類。根據(jù)化學(xué)成分組成及其利用分類，能源植物可以分為［2］:①糖料植物:該類植物富含可溶性糖，主要用于生產(chǎn)燃料乙醇，有甘蔗、甜高粱和甜菜等;②淀粉植物:該類植物富含淀粉，也主要用于生產(chǎn)燃料乙醇，主要包括小麥、玉米等禾谷類作物及甘薯、木薯和馬鈴薯等薯類作物;③油料植物:指富含油脂的高等植物，提取油脂后通過脂化過程形成脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯類物質(zhì)，即生物柴油，如油菜、蓖麻和大豆等產(chǎn)油作物以及麻瘋樹、油棕櫚、黃連木和文冠果等木本植物;④含油微藻植物:富含烴類或脂類物質(zhì)的微藻也可用以生產(chǎn)生物柴油，由于含油微藻高效的生產(chǎn)能力，可在廢棄地及其他沒有農(nóng)業(yè)利用價(jià)值的土地上，利用廢水甚至高含鹽量的水大規(guī)模培養(yǎng)，因而有很好的應(yīng)用前景［3］;⑤木質(zhì)纖維素植物:該類植物富含木質(zhì)纖維素，轉(zhuǎn)化應(yīng)用范圍很廣泛，用于生產(chǎn)固體顆粒燃料，或獲得熱能、電能、沼氣及燃料乙醇等，如楊樹、桉樹、象草、柳枝稷和喜百草等。

2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在能源植物育種中的應(yīng)用

自然狀態(tài)下的能源植物并不是最理想的生產(chǎn)物種，通過引進(jìn)良種與當(dāng)?shù)刂参镫s交后篩選培育高效、高產(chǎn)的能源植物已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，然而傳統(tǒng)的育種手段已不能滿足現(xiàn)今社會(huì)對(duì)能源植物的需求。近年來，隨著基因克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米、大豆和棉花等主要農(nóng)作物上都得到了較好的應(yīng)用。但由于轉(zhuǎn)基因食品相關(guān)的商業(yè)應(yīng)用仍受到嚴(yán)格限制，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在以食用為目的的作物上的研究和應(yīng)用也面臨阻礙，由此為能源植物的遺傳改良提供了新的機(jī)遇。轉(zhuǎn)基因技術(shù)雖然較常規(guī)育種技術(shù)復(fù)雜，但具有常規(guī)育種不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，它可以根據(jù)育種目標(biāo)，打破生殖隔離，將供體生物中的目的基因整合到受體植物中，在基因水平上定向改造植物的遺傳性狀，從而形成轉(zhuǎn)基因新品種或新種質(zhì)，大大提高了育種的目的性和可操作性。因此，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以作為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效新型能源植物新品種的有效途徑。

2.1 提高能源植物的生物量

人類期望的能源植物是擁有較高的太陽(yáng)能轉(zhuǎn)化利用率、較快的光合速度和較高的干物質(zhì)積累能力以及較快的生長(zhǎng)速率。然而目前普通植物對(duì)太陽(yáng)光的利用效率都比較低，不到4%。況且我國(guó)耕地有限，發(fā)展能源植物必須要保證糧食安全，要立足于“不與人爭(zhēng)糧、不與糧爭(zhēng)地”，盡可能選擇邊際土地來發(fā)展能源植物資源產(chǎn)業(yè)。與正常的耕地相比，在邊際土地上種植相同的作物，產(chǎn)量具有很大的變動(dòng)范圍。因此，在邊際土地上發(fā)展能源植物，更需要選擇高光效、高生物量的能源植物。有研究表明，倘若能通過改良將植物的光能利用效率提高1%，世界上1/10的農(nóng)田面積就足以提供目前人類使用的所有化石能源［4］。通過增加植物對(duì)光能的利用效率或捕獲效率可以提高植物的總生物量。植物通過光合作用吸收二氧化碳受多種因素影響，包括光合作用機(jī)制、碳流量、光呼吸和光抑制作用及同化物分配和利用等。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提高植物的生物量已有大量報(bào)道(見表 1)，主要包括調(diào)控植物光合作用［5，6］、調(diào)控卡爾文循環(huán)中的碳流量［7，8］、操縱植物營(yíng)養(yǎng)代謝過程中的基因［9～11］以及延遲或阻礙植物開花［12］等。

大部分植物在光合作用中同化二氧化碳的最初產(chǎn)物是三碳化合物3-磷酸甘油酸，被稱為C3植物;而另一部分植物二氧化碳同化的最初產(chǎn)物是四碳化合物蘋果酸或天門冬氨酸，被稱作C4植物。目前多種C4植物光合作用途徑中的一些關(guān)鍵酶，如丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)以及無機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和脫氧羧腐胺賴氨酸合酶(DHS)等的基因已被成功轉(zhuǎn)入馬鈴薯、水稻、楊樹和擬南芥等C3植物中，使相應(yīng)轉(zhuǎn)基因植物的光合能力及產(chǎn)量均不同程度地得到提高(見表1)。以上這些研究表明，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來操縱植物中許多基因的表達(dá)對(duì)植物產(chǎn)量有比較明顯的影響，雖然這些研究成果未見有實(shí)際應(yīng)用的例子，但是同樣的策略可以應(yīng)用到能源植物中，為培育新型高產(chǎn)能源植物提供了參考依據(jù)。

表1 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物生物量的報(bào)道 Table 1 The reports of using transgenic technology to improve plant biomass.

2.2 應(yīng)用于纖維素類能源植物的研究

利用木質(zhì)纖維素類能源植物生產(chǎn)燃料乙醇在國(guó)內(nèi)外已有大量研究，但所開發(fā)的技術(shù)始終未能在規(guī)模生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，最根本的原因是目前的技術(shù)中仍然存在著一些尚未解決的關(guān)鍵問題，嚴(yán)重制約著植物纖維素燃料乙醇的生產(chǎn)［19～21］。首先是前期將木質(zhì)纖維素物質(zhì)降解為中間物質(zhì)以及去除木質(zhì)素的預(yù)處理過程成本過高;其次是纖維素水解復(fù)合酶的價(jià)格昂貴導(dǎo)致整個(gè)生產(chǎn)過程成本偏高［22］。與玉米淀粉生產(chǎn)乙醇相比，以上兩個(gè)過程的花費(fèi)使得纖維素乙醇的生產(chǎn)成本高2～3倍。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來解決植物纖維燃料乙醇生產(chǎn)過程中遇到的瓶頸問題已有大量報(bào)道。

2.2.1 降低植物的木質(zhì)素含量 降低木質(zhì)纖維中的木質(zhì)素含量、提高纖維素含量將有利于降低木質(zhì)纖維的前處理成本。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變木質(zhì)素合成途徑中不同基因的表達(dá)來降低木質(zhì)素的含量、提高纖維素含量已有大量報(bào)道(見表2)。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)木質(zhì)素生物合成調(diào)控的研究主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面［31］:①木質(zhì)素合成總量的調(diào)節(jié)。主要涉及的酶類依次有苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸4-羥基化酶(C4H)、4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)、肉桂醇脫氫酶(CAD)和香豆酰輔酶A還原酶(CCR)，這些酶活性的高低與木質(zhì)素的總量具有密切的相關(guān)性;②木質(zhì)素單體特異合成成分的調(diào)控。相關(guān)的酶類主要有咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)、咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)和阿魏酸5羥基化酶(F5H)，這些酶的表達(dá)對(duì)木質(zhì)素單體的特異合成有較大的影響，決定了各種單體在木質(zhì)素總量中的比例。

雖然通過調(diào)控木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)可以降低或是改變木質(zhì)素的含量與成分，但是還要保證調(diào)控這些基因的表達(dá)不影響轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)發(fā)育。此外，一些特定植物為了適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的需要，其細(xì)胞壁的木質(zhì)素形成受到精細(xì)的時(shí)空調(diào)節(jié)［32～34］。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)減少木質(zhì)素含量、改變其結(jié)構(gòu)與成分的同時(shí)還需要對(duì)木質(zhì)素合成途徑的遺傳調(diào)控開展更多基礎(chǔ)性的研究，以避免對(duì)植物造成長(zhǎng)期的傷害。

表2 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控木質(zhì)素合成途徑中的相關(guān)酶的表達(dá) Table 2 The expression of enzymes in lignin synthesis regulation pathway using transgenic technology.

2.2.2 在植物中過表達(dá)纖維素降解酶類 將纖維素降解為葡萄糖的過程需要內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三種酶共同作用。生產(chǎn)纖維素酶的方法一般采用微生物發(fā)酵法，但是由于這種方法工藝復(fù)雜，提純過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，導(dǎo)致生產(chǎn)成本昂貴。如果能夠利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將纖維素酶直接在植物中表達(dá)，利用植物作為生物反應(yīng)器產(chǎn)生降解纖維素的酶類，在木質(zhì)纖維素降解過程中就不需要或可減少加入來源于微生物的酶，這樣就可以大大降低燃料乙醇的生產(chǎn)成本［21，35，36］。目前，嗜酸纖維素分解菌(Acidothermus cellulolyticus)的 1，4-β-內(nèi)切葡聚糖酶的催化區(qū)域E1已分別在煙草、玉米、擬南芥、馬鈴薯、水稻和玉米中成功表達(dá)(見表3)［37～44］。另外，來自嗜熱單孢菌(Thermpbifida fusca)的耐熱纖維素酶Cel6A和Cel6B基因以及來自海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)的β-葡聚糖酶基因等也在煙草等植物中成功表達(dá)(見表3)［45～55］。這些研究表明在植物中生產(chǎn)纖維素酶是可行的，尤其在擬南芥中表達(dá)的酶含量可達(dá)植物可溶性蛋白含量的26%［39］。值得一提的是，目前在植物中表達(dá)纖維素酶大多集中在非生物質(zhì)原料作物中，而在生長(zhǎng)快速的木質(zhì)纖維素原料作物(如芒草、柳枝稷、桉樹和楊樹等)中的研究相對(duì)較少。

表3 在植物中表達(dá)耐熱或極端嗜熱酶的研究 Table 3 Studies of heat-resistant enzymes or extreme thermophilic enzymes expressed in plants.

2.3 應(yīng)用于富含油脂能源植物的研究

生物柴油是清潔的可再生能源，是優(yōu)質(zhì)石化柴油代用品。目前生物柴油面臨的主要問題是原料的油脂含量低、原料少而成本高，因此生物柴油能否實(shí)用化的關(guān)鍵是要采用廉價(jià)的原料來提高轉(zhuǎn)化從而降低成本。運(yùn)用基因工程技術(shù)來調(diào)控脂類合成途徑中相關(guān)酶基因的表達(dá)，從而提高植物脂肪酸的含量或改變脂肪酸組分，是解決上述問題的有效手段。

2.3.1 提高油料植物的含油量 脂肪酸生物合成途徑的重要步驟是乙酰-CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACCase)催化乙酰輔酶A生成丙酰-CoA，植物脂肪酸的含量與ACCase的活性呈正相關(guān)。因此，可以利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)超量表達(dá)ACCase來提高含油植物的脂肪酸含量。來源于不同植物的ACCase基因已在油菜、玉米和麻瘋樹等植物中獲得了過表達(dá)，并且相應(yīng)地提高了種子的含油量［56～58］。Dong 等［57］將粟的 ACCase 基因轉(zhuǎn)入玉米，增加了玉米對(duì)稀禾啶的抗性，轉(zhuǎn)基因玉米的種子含油量比非轉(zhuǎn)基因玉米增加24%～65%。Roesler等［58］將擬南芥的一個(gè)ACCase同源基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜中，在種子特異性啟動(dòng)子的作用下獲得了表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株T1代種子中ACCase的活性增加了1.7～1.9倍，質(zhì)體中丙酰-CoA的含量也得到提高，相應(yīng)地種子產(chǎn)油量提高了3% ～5%。Dunahay等［59］將 ACCase基因在硅藻中過量表達(dá)，硅藻的ACCase活性增加了約2～3倍。此外，也有許多研究ACCase不同亞基在脂肪酸合成中作用的報(bào)道［60，61］，如 Alisa等［60］克隆和表達(dá)了油棕生物素羧化酶基因(accC)和β-羧基轉(zhuǎn)移酶基因(accD)，結(jié)果表明accD的表達(dá)對(duì)于維持異質(zhì)型ACCase的水平和植物種子的含油量起最主要的作用。雖然ACCase的含量對(duì)脂肪酸的合成起著重要的作用，但是有人推測(cè)ACCase的含量對(duì)油脂積累的影響因物種而異，ACCase含量對(duì)油脂含量低的物種影響大于油脂含量高的物種［62］。由于脂肪酸的合成涉及多個(gè)酶的作用，要想通過上調(diào)其中一種酶而使油料植物的含油量大幅度提高是不可能的，研究者們開始關(guān)注脂肪酸合成途徑的轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶和其他調(diào)控因子［63，64］。

2.3.2 改良植物中的脂肪酸成分 植物在脂肪酸代謝上存在著多樣性和可塑性，不同的植物在油脂脂肪酸的構(gòu)成上有很大區(qū)別。有些植物油的工業(yè)價(jià)值被脂肪酸的成分所限制，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)油料植物種子中的脂肪酸成分進(jìn)行改良是一種有效的手段，主要包括通過RNA干擾調(diào)控脂肪酸脫氫酶基因活性，調(diào)整脂肪酸分子在三酰甘油脂上的分布，修飾脂肪酸鏈的長(zhǎng)度和不飽和度以及調(diào)整特定脂肪酸成分等。將擬南芥的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)基因在煙草中表達(dá)，轉(zhuǎn)基因煙草的葉片中三酰甘油的積累增加了20倍，總脂肪酸和磷脂的含量都有所提高;在煙草中表達(dá)擬南芥中調(diào)控種子成熟和種子油存儲(chǔ)的主調(diào)節(jié)因子也能提高總脂肪酸含量［65］。Liu 等［66］將脂酰-ACP-Δ9去飽和酶基因ghSAD-1和 ω6去飽和酶基因ghFAD2-1分別轉(zhuǎn)進(jìn)棉花，提高了棉花的硬脂酸和油酸的含量。Kinney等［67］抑制大豆中的脂酰去飽和酶，導(dǎo)致大豆油中脂肪酸的組成比例發(fā)生改變。Kaczmarzyk等［68］將微藻中編碼脂酰輔酶 A合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase，LACS)基因敲除后，提高了微藻中脂肪酸濃度;同樣，敲除擬南芥中編碼LACS的兩種同工酶基因，切斷了種子中脂肪酸進(jìn)入β-氧化的途徑，從而增加了種子的油脂含量［69］。

3 展望

我國(guó)作為一個(gè)資源大國(guó)，植物資源非常豐富，為能源植物資源的開發(fā)提供了優(yōu)越的條件。然而要對(duì)這些能源植物資源進(jìn)行有效的開發(fā)與利用，所面臨的最主要的問題是利用能源植物生產(chǎn)再生能源的成本過高。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，已在提高植物總的生物量、改變植物木質(zhì)纖維素的成分、在植物中生產(chǎn)纖維素酶以及改變油料植物的油脂成分等方面進(jìn)行了許多有益的嘗試，這些研究成果對(duì)于降低能源植物向生物燃料(生物乙醇、生物柴油)的轉(zhuǎn)化成本、提高能源轉(zhuǎn)化效率有著非常重要的意義。隨著生物化學(xué)與分子生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，人們對(duì)植物的結(jié)構(gòu)基因組和功能基因組的研究將更加深入，對(duì)能源植物的能量轉(zhuǎn)化、富集和分配相關(guān)的基因功能及其調(diào)控機(jī)理也將不斷明確，利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在分子基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)和優(yōu)化能源植物將成為今后改良能源植物、培育優(yōu)良能源植物新品種的重要研究方向。

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