王彩虹， 牛燦芳， 羅會(huì)穎， 楊培龍， 姚 斌

農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081

半纖維素是目前世界上存在的第二大豐富的雜聚合物，通常與纖維素和木質(zhì)素一起存在于植物細(xì)胞壁中［1，2］。甘露聚糖和木聚糖一起構(gòu)成了半纖維素的主要成分［3，4］。完全消化甘露聚糖需要幾種酶的協(xié)同作用，包括β-1，4-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和 α-半乳糖苷酶等。

β-甘露聚糖酶是一類能水解含甘露糖的多糖水解酶的總稱，根據(jù)酶作用底物特異性和作用特點(diǎn)可以分為外切β-甘露聚糖酶和內(nèi)切β-甘露聚糖酶兩種類型［5］。β-甘露聚糖酶屬于半纖維素酶類，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于飼料、造紙、洗滌劑、食品和石油開(kāi)采等行業(yè)，以及尚未完全開(kāi)發(fā)的生物質(zhì)能源等領(lǐng)域，例如在乙醇生產(chǎn)過(guò)程中，一系列的酶類包括纖維素酶類、木聚糖酶和甘露聚糖酶等一起作用可以有效地將木質(zhì)纖維素類物質(zhì)水解為糖類［6］。大多數(shù)工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域需要在高溫環(huán)境中進(jìn)行［7］，為了滿足工業(yè)應(yīng)用的需求，尋找與改造能在高溫環(huán)境中起催化作用的嗜熱酶是一個(gè)急需解決的問(wèn)題，因此，對(duì)嗜熱β-甘露聚糖酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的研究具有很高的理論價(jià)值和實(shí)際意義［8］。

1 β-甘露聚糖酶

1.1 β-甘露聚糖酶的來(lái)源

β-甘露聚糖酶的來(lái)源非常廣泛，包括動(dòng)植物和微生物。其中動(dòng)物來(lái)源主要是低等動(dòng)物(如蝸牛和海洋軟體動(dòng)物等)的腸道分泌液，哺乳動(dòng)物體內(nèi)一般不含此酶。Yamaura等［9］從海螺和一種海洋軟體動(dòng)物中純化出了內(nèi)切β-甘露聚糖酶;Xu等［10］從軟體動(dòng)物貽貝中也分離純化得到了β-甘露聚糖酶。許多植物(如蘆筍、咖啡、胡蘿卜、魔芋、四棱豆、長(zhǎng)角豆、咖啡豆和瓜兒豆等)萌發(fā)的種子以及番茄果實(shí)和種子中都含有甘露聚糖酶［11］。而微生物是甘露聚糖酶的最主要來(lái)源，包括細(xì)菌、真菌和放線菌等。截至目前，研究較多的是細(xì)菌類的芽胞桿菌、枯草桿菌和假單胞菌，真菌類的曲霉、里氏木霉，以及放線菌類的鏈霉菌等［12］。微生物來(lái)源的β-甘露聚糖酶優(yōu)點(diǎn)很多，包括酶活性高、提取方便、生產(chǎn)成本低、pH和溫度作用范圍廣以及底物專一性較高等。因此，微生物來(lái)源的β-甘露聚糖酶已成為工業(yè)用酶的主要來(lái)源和近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。尤其極端微生物生長(zhǎng)的特殊條件與工業(yè)環(huán)境很相近，隨著對(duì)嗜熱酶反應(yīng)機(jī)理和分子生物學(xué)研究的逐步深入，開(kāi)發(fā)嗜熱酶產(chǎn)品具有廣闊的前景［13］。

1.2 β-甘露聚糖酶的分類

β-甘露聚糖酶根據(jù)最適pH的不同可分為酸性β-甘露聚糖酶、中性β-甘露聚糖酶和堿性β-甘露聚糖酶;根據(jù)最適溫度的不同，可分為嗜熱β-甘露聚糖酶、中溫β-甘露聚糖酶和低溫β-甘露聚糖酶。嗜熱甘露聚糖酶常用的獲取途徑包括:從嗜熱微生物中直接分離獲得，從常規(guī)生物來(lái)源中獲得，或通過(guò)蛋白質(zhì)工程、基因改造的方法獲得。

糖苷水解酶由催化模塊、非催化的碳水化合物結(jié)合模塊以及l(fā)inker區(qū)和其他一些輔助模塊組成［14］。根據(jù)催化域氨基酸序列及結(jié)構(gòu)特征，糖苷水解酶被劃分為133個(gè)家族。β-甘露聚糖酶屬于糖苷水解酶(GH)5、26或113家族。截至目前(2014年8月)，公共數(shù)據(jù)庫(kù)中(Genbank和 http://www.cazy.org/)已經(jīng)報(bào)道的β-甘露聚糖酶序列共有232個(gè)，包括GH5家族126個(gè)(其中細(xì)菌來(lái)源的56個(gè)，真菌來(lái)源的70個(gè))，GH26家族104個(gè)(其中細(xì)菌來(lái)源的88個(gè)，真菌來(lái)源的9個(gè)，另有7個(gè)未進(jìn)行分類)，GH113家族目前報(bào)道的只有2個(gè)(均來(lái)源于細(xì)菌)。其中有22個(gè)β-甘露聚糖酶開(kāi)展了蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)解析研究，包括GH5家族14個(gè)(其中細(xì)菌來(lái)源的8個(gè)，真菌來(lái)源的有6個(gè))，GH26家族7個(gè)(其中細(xì)菌來(lái)源的5個(gè)，真菌來(lái)源的2個(gè))及GH113家族1個(gè)(來(lái)源于細(xì)菌)。根據(jù)序列的相似性，GH5甘露聚糖酶又被分為三個(gè)亞家族，包括GH5-7、GH5-8和GH5-10［15］。序列相似性在25%以上的甘露聚糖酶歸為同一個(gè)亞家族，其中細(xì)菌來(lái)源的GH5甘露聚糖酶多屬于GH5-8亞家族，真菌來(lái)源的GH5甘露聚糖酶多屬于GH5-7亞家族。盡管已知GH5和GH26在親核基團(tuán)、供體質(zhì)子和折疊方式上均相似，但是它們序列相似性不高。甘露聚糖酶氨基酸序列的保守性在不同類生物個(gè)體及不同家族酶蛋白之間有較大差別。

1.3 β-甘露聚糖酶的作用方式和水解產(chǎn)物

β-甘露聚糖酶屬于典型的(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)，催化殘基分別位于第4和第7 β折疊片上，且至少有4個(gè)殘基與底物結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)［16］。不同酶中碳水化合物結(jié)合模塊共發(fā)現(xiàn)38 674個(gè)，其分類共分布在69個(gè)家族和215個(gè)未分類的碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate-binding module，CBM)家族。

根據(jù)構(gòu)成，可以將催化底物甘露聚糖分為四類:均一甘露聚糖(β-1，4-D-甘露糖構(gòu)成的主鏈)、葡甘露聚糖(β-1，4-D-甘露糖和 β-1，4-D-葡萄糖構(gòu)成的主鏈)、半乳甘露聚糖(帶有半乳糖側(cè)鏈的β-1，4-D-甘露糖)和半乳葡甘露聚糖(帶有半乳糖側(cè)鏈的 β-1，4-D-甘露糖和 β-1，4-D-葡萄糖構(gòu)成的主鏈)［17］。這些多糖均呈線狀的或分枝的多糖苷鏈。甘露聚糖存在于自然界中的許多植物中，半乳糖甘露聚糖大多存在于長(zhǎng)角豆和瓜兒豆的胚乳中，而葡萄糖甘露聚糖大多存在于魔芋球莖中。不同來(lái)源的甘露聚糖有著不同的構(gòu)成，它們的分子量以及主側(cè)鏈的組成均不相同(見(jiàn)表1)。

β-1，4-甘露聚糖酶的活性受到側(cè)鏈以及主鏈上D-葡萄糖的含量的影響。α-半乳糖殘基和葡萄糖殘基在主鏈中的位置、含量及酯酞化的程度，底物本身的物理狀態(tài)(例如溶液的黏度和底物狀態(tài))也會(huì)影響不同來(lái)源的β-甘露聚糖酶的鏈切割方式和水解程度。例如結(jié)晶態(tài)的甘露聚糖就不易被酶降解［19，20］，朱劼等［20］在酸性 β-甘露聚糖酶的固態(tài)發(fā)酵工藝研究中發(fā)現(xiàn)水與固料的比例為1.2∶1時(shí)要比0.8∶1時(shí)酶活高出1.6倍。有學(xué)者研究甘露聚糖酶降解魔芋膠或槐豆膠時(shí)，作用于多糖鏈非還原端的第3個(gè)或第4個(gè)糖分子，降解產(chǎn)物為 MG、GM、MM、GG、MMM、GGM、GMM、MGM、MMMM、GMMG、GMMM、GGMM 和 MMMMM［21］。雖然不同來(lái)源甘露聚糖酶的切割方式和水解程度不同，但主要產(chǎn)物都是低聚糖，很少產(chǎn)生或不產(chǎn)生單糖，如 Han等［22］發(fā)現(xiàn) Man5A-TM1和 Man5ATM2分解多聚糖為聚合度大于3的低聚糖;Bacillus sp.MSJ-5來(lái)源的甘露聚糖酶水解多聚糖為二糖至六糖，以及非常少量的單糖［23］。

表1 不同來(lái)源的甘露聚糖的組成［18］ Table 1 The composition of different sources of mannans.

2 嗜熱β-甘露聚糖酶的研究進(jìn)展

2.1 嗜熱微生物與嗜熱酶

能夠在極端環(huán)境下生長(zhǎng)的微生物稱為極端微生物［24］。根據(jù)極端微生物的不同生活環(huán)境，極端微生物又被分為嗜鹽菌、嗜熱菌、嗜壓菌和嗜酸菌等。極端微生物能夠生產(chǎn)一些具有商業(yè)價(jià)值的工業(yè)產(chǎn)品，例如，酶、抗生素和激素等［25，26］。大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)溫度范圍為20～45℃之間，而將能夠在45℃以上正常生長(zhǎng)的微生物稱為嗜熱微生物［27］。其中嗜熱細(xì)菌和嗜熱古菌近來(lái)一直是人們研究的主要對(duì)象，而對(duì)嗜熱真菌的關(guān)注則要少一些。

嗜熱酶是一類酶催化最適反應(yīng)溫度為60℃以上的酶，主要是從嗜熱微生物中獲得［28］。從20世紀(jì)90年代開(kāi)始，生物科技的發(fā)展和應(yīng)用促進(jìn)了人們對(duì)嗜熱酶的探索研究［29］。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)嗜熱微生物產(chǎn)生的嗜熱酶在高溫條件下具有良好的熱穩(wěn)定性，克服了中溫酶(20～55℃)和低溫酶(2～20℃)在工業(yè)應(yīng)用中活性不穩(wěn)定的現(xiàn)象。在工業(yè)應(yīng)用中，嗜熱酶較中溫酶有非常明顯的優(yōu)勢(shì):第一，可降低酶制劑的成本。由于嗜熱酶的穩(wěn)定性好，使得該類酶即使在室溫下進(jìn)行分離提純、包裝運(yùn)輸也不失活，這就大大降低了生產(chǎn)成本。第二，可提高反應(yīng)的催化效率。由于反應(yīng)溫度的提高，使得分子運(yùn)動(dòng)速度加快，繼而酶催化能力大大加強(qiáng)。第三，能夠降低反應(yīng)能耗。由于嗜熱酶具有較高的熱穩(wěn)定性，使得在生產(chǎn)中不需要復(fù)雜的冷卻裝置來(lái)進(jìn)行溫度的調(diào)節(jié)，這樣在降低生產(chǎn)成本、減少能耗的同時(shí)，也減少了冷卻過(guò)程對(duì)環(huán)境所造成的污染。第四，降低雜菌的污染。嗜熱酶往往具有較高的反應(yīng)溫度(大于60℃)，在此溫度下，少有雜菌能夠生存，繼而減少了細(xì)菌代謝物對(duì)產(chǎn)物的污染。第五，對(duì)化學(xué)變性劑及相關(guān)金屬離子具有較高的耐受力，因此擴(kuò)大了酶反應(yīng)的適用范圍［30，31］。

嗜熱酶較高的反應(yīng)活性以及較好的穩(wěn)定性，使得它在生物質(zhì)能源、化學(xué)制品、食品、飼料、醫(yī)藥和石油開(kāi)采等方面都有廣泛的應(yīng)用前景。但是目前從天然環(huán)境中獲得的嗜熱甘露聚糖酶較少［32～34］，而且天然存在的嗜熱甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性并不理想，影響了其在生產(chǎn)應(yīng)用中的效果，如盧海強(qiáng)等［33］的Man5XZ7最適溫度為80℃，但僅在50℃下保持穩(wěn)定。再者，動(dòng)物體內(nèi)消化道為酸性環(huán)境，飼料用甘露聚糖酶應(yīng)在強(qiáng)酸性條件下能發(fā)揮作用，但目前已獲得的嗜熱甘露聚糖酶的最適 pH 大多都在 4.0 ～ 5.0［33，34］。因此，為了更好地適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的需要，已開(kāi)始嘗試通過(guò)基因改造的方法提高甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性并改變其酸堿適應(yīng)性。

2.2 嗜熱β-甘露聚糖酶及資源篩選

嗜熱β-1，4-甘露聚糖酶具有高比活，以及高溫下高活性的特點(diǎn)［7，34］，在很多工業(yè)領(lǐng)域都倍受關(guān)注。例如酶法水解半乳甘露聚糖被應(yīng)用于石油和天然氣行業(yè)來(lái)提高石油和天然氣的開(kāi)采率，由于石油開(kāi)采需要80℃以上的極端溫度，應(yīng)用嗜熱甘露聚糖酶非常適合［7］。到目前為止，已報(bào)道的嗜熱甘露聚糖酶約有30個(gè)，其中，最適溫度大于80℃的極端嗜熱甘露聚糖酶有6個(gè)(見(jiàn)表2)。

表2 最適溫度大于80℃的極端嗜熱甘露聚糖酶 Table 2 Extremely thermophilic mannanases with optimum temperature higher than 80℃.

之前大多數(shù)已經(jīng)報(bào)道的嗜熱甘露聚糖酶都屬于26家族［35］，但近幾年從真菌中分離得到了屬于5家族成員的極端嗜熱甘露聚糖酶，包括來(lái)自Aspergillus niger BK01 的 ManBK［32］，來(lái)自 Aspergillus nidulans XZ7 的 Man5XZ7［33］和來(lái)自 Talaromyces leycettanus JCM12802 的 Man5A［34］。

2.3 嗜熱β-甘露聚糖酶的特性

在微生物來(lái)源的甘露聚糖酶中，已有90個(gè)GH5 β-甘露聚糖酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定，其中42個(gè)來(lái)源于細(xì)菌，48個(gè)來(lái)源于真菌。GH26中有41個(gè)進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定，其中34個(gè)來(lái)源于細(xì)菌，只有7個(gè)來(lái)源于真菌。而113家族中目前只有一個(gè)進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定，其來(lái)源于細(xì)菌。

目前已經(jīng)報(bào)道的甘露聚糖酶的最適溫度大多在50～60℃之間。而關(guān)于嗜熱甘露聚糖酶的報(bào)道還較少。真菌來(lái)源的甘露聚糖酶最適溫度最高的為 90℃，來(lái)源 于 Talaromyces leycettanus JCM12802［34］，其次是來(lái)源于 A.nidulans XZ3 的Man5XZ3［38］和來(lái)源于 Aspergillus niger BK01 的ManBK［39］，最適溫度均為80℃。細(xì)菌甘露聚糖酶最適溫度最高的為90℃，來(lái)源于Thermotoga neapolitana［35］。

2.4 甘露聚糖酶的嗜熱性分子改良

影響甘露聚糖酶蛋白嗜熱的結(jié)構(gòu)因素有很多，包括氫鍵、鹽橋和二硫鍵等。在 β-甘露聚糖酶嗜熱改良方面，已經(jīng)有多個(gè)報(bào)道，在β-甘露聚糖酶熱穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)研究方面也已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展［40］。目前，主要是通過(guò)對(duì)從自然界中獲得的甘露聚糖酶進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，通過(guò)同源建模、分子對(duì)接、二級(jí)結(jié)構(gòu)分析以及動(dòng)力學(xué)模擬等手段對(duì)其進(jìn)行分子改良從而獲得嗜熱的β-甘露聚糖酶。此外，也有文獻(xiàn)報(bào)道糖基化修飾以及碳水化合物結(jié)合模塊對(duì)甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性有影響［40］。

2.4.1 N-糖基化修飾 糖基化是在酶的控制下，蛋白質(zhì)或脂質(zhì)附加上糖類的過(guò)程。糖基化發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)糖基化作用之后，可形成糖蛋白。蛋白質(zhì)糖基化可以根據(jù)糖苷鏈類型的不同分為四類，包括-O-糖苷鍵型(以絲氨酸、蘇氨酸、羥賴氨酸和羥脯氨酸的羥基為連接點(diǎn)形成);-N-糖苷鍵型(以天冬酞胺的酚胺基、N末端氨基酸的α-氨基以及賴氨酸或精氨酸的ω-氨基為連接點(diǎn)形成);醋糖苷鍵型(以天冬氨酸或谷氨酸的游離羧基為連接點(diǎn)形成)以及以半胱氨酸為連接點(diǎn)的糖苷鍵。

目前已經(jīng)有多篇文獻(xiàn)報(bào)道N-糖基化對(duì)酶的熱穩(wěn)定性的促進(jìn)作用。如謝春芳等［41］以來(lái)源于Armillariella tabescens的β-甘露聚糖酶 Man47為研究對(duì)象，利用計(jì)算化學(xué)對(duì)Man47進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，經(jīng)過(guò)分子對(duì)接、二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和糖基化的可行性分析后，構(gòu)建具有 EAS(enhanced aromatic sequence)序列的突變體G-123作為N-糖基化的突變位點(diǎn)以提高其熱穩(wěn)定性。王彩虹等［34］從Talaromyces leycettanus JCM12802中獲得的Man5A，其糖基化程度高的蛋白Man5A1在70℃下處理1 h，酶活沒(méi)有損失，而糖基化程度低的蛋白Man5A2只剩余了40%的酶活。Fonseca-Maldonado等［42］和 Wei等［43］也報(bào)道了類似的研究結(jié)果。研究顯示，N-糖基化提高酶的熱穩(wěn)定性可能是由于N-糖基化減少了蛋白的不正確折疊從而提高了蛋白折疊的可逆性［44］。

2.4.2 碳水化合物結(jié)合模塊對(duì)熱穩(wěn)定性的影響 糖苷水解酶中的碳水化合物結(jié)合模塊(CBM)結(jié)構(gòu)域可能會(huì)促進(jìn)酶與底物的聯(lián)系，從而促進(jìn)酶的熱穩(wěn)定性。目前已經(jīng)有很多文獻(xiàn)報(bào)道CBM對(duì)甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性有促進(jìn)作用。王彩虹等［34］從 Talaromyces leycettanus JCM12802 中獲得的Man5A，在70℃處理1 h，Man5A可以維持幾乎100%的活性，然而其去掉 CBM(ManACBM)后穩(wěn)定性明顯降低，ManA-CBM僅維持70%的活性。盧海強(qiáng)等［38］從Aspergillus nidulans XZ3中獲得的Man5XZ3的熱穩(wěn)定性要明顯優(yōu)于去掉CBM 后的 Man5ΔCBM，Man5XZ3在60℃處理1 h能維持50%的酶活，Man5ΔCBM僅能維持30%左右。

3 展望

到目前為止，嗜熱β-甘露聚糖酶的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。首先，在嗜熱β-甘露聚糖酶的基因資源挖掘方面，已經(jīng)從嗜熱微生物中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)最適溫度大于80℃的極端嗜熱甘露聚糖酶，其中 Aspergillus niger BK01 來(lái)源的 ManBK［39］和TalaromycesleycettanusJCM12802來(lái)源的Man5A［34］的熱穩(wěn)定溫度都能達(dá)到70℃。今后利用生物信息學(xué)分析、環(huán)境基因組或轉(zhuǎn)錄組功能基因的直接克隆等技術(shù)將大大加快嗜熱β-甘露聚糖酶基因資源的獲得。

很多β-甘露聚糖酶雖然極端嗜熱，但是存在熱穩(wěn)定性差、不能在酸性環(huán)境發(fā)揮作用，以及表達(dá)量低等特點(diǎn)。因此在今后研究的重點(diǎn)將集中于以下幾個(gè)方面。第一，通過(guò)生物信息學(xué)分析對(duì)嗜熱甘露聚糖酶進(jìn)行改造，以適應(yīng)生產(chǎn)需求;第二，對(duì)影響外源嗜熱甘露聚糖酶的轉(zhuǎn)譯、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌等相關(guān)的分子機(jī)制進(jìn)行研究，構(gòu)建基于受體菌株優(yōu)化、基因優(yōu)化、表達(dá)元件優(yōu)化、目標(biāo)基因定點(diǎn)整合與拷貝數(shù)控制技術(shù)等的高效生物反應(yīng)器，以提高表達(dá)量。目前，嗜熱甘露聚糖酶基因序列及其酶蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)不斷累積，新的具有嗜熱特性天然酶也時(shí)有發(fā)現(xiàn)，計(jì)算機(jī)輔助酶分子模擬技術(shù)的發(fā)展使人們對(duì)嗜熱β-甘露聚糖酶的嗜熱機(jī)制及快速分子改良研究成為可能。

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