孫盛梅，KOUN Linka，張丹鳳，趙巖巖，Rajina SHRESTHA

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江佳木斯154003)

子宮內(nèi)膜異位癥是最常見的良性婦科疾病之一，它可能會影響10%育齡婦女。子宮內(nèi)膜異位癥的典型癥狀是疼痛和不孕。子宮內(nèi)膜異位癥的特點表現(xiàn)是由子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)在子宮腔以外的異位。病變通常位于腹膜，在卵巢或浸潤進入腹腔內(nèi)的器官［1］。有幾種理論對子宮內(nèi)膜異位癥的病因，已被認為腹膜，直腸陰道深部，卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫，并稱為子宮內(nèi)膜異位，有所不同來源［2］。

雖然陰道超聲檢查是有價值的，特別是在女性卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫，子宮內(nèi)膜異位癥的診斷通常需要腹腔鏡確診。超聲不是腹膜植入物和粘連的診斷或疾病分期的有用工具。此外，腫瘤性卵巢囊腫與子宮內(nèi)膜異位囊腫在超聲表達相似，因此，需要在診斷慎重考慮。此外，子宮內(nèi)膜異位癥是增加發(fā)生卵巢癌的某些亞型的風險，如子宮內(nèi)膜樣和透明細胞癌［3］。有數(shù)據(jù)表明，40%的子宮內(nèi)膜樣卵巢癌和50%的透明細胞性卵巢癌的是與子宮內(nèi)膜異位癥相關聯(lián)［4］。子宮內(nèi)膜樣卵巢癌和透明細胞癌被認為是出現(xiàn)，至少部分來自子宮內(nèi)膜異位癥。類似的病理生理機制可能參與了子宮內(nèi)膜異位癥的進展，以及在其轉(zhuǎn)變?yōu)槁殉擦鰳硬∽儯?］。

目前，CA125是在卵巢癌診斷中最常用的生化標志物。然而，它涉及較高的假陽性率在良性婦科疾病，如子宮內(nèi)膜異位癥［6］。此外，CA125在識別早期卵巢癌具有非常低的敏感性［7］。因此，為了提高卵巢癌診斷的特異性和敏感性，采用新的生物標志物，如HE4(人附睪分泌蛋白E4；WAP四二硫化物核心域蛋白2，WFDC2)單獨或與CA125的組合已被廣泛研究［8，9］。

除了卵巢癌的診斷，CA125可用于評估治療子宮內(nèi)膜異位癥的效力以及子宮內(nèi)膜異位癥的復發(fā)。然而，由于缺乏敏感性和特異性已經(jīng)顯著阻礙生物標記物作為診斷測試［10，11］。另一方面，標志物包括CA125已經(jīng)被建議提出來預測子宮內(nèi)膜異位癥的患者的一個子集存在［12］。

人類附睪分泌蛋白E4是一種新的血清學標志物用于卵巢癌的診斷。與以前使用的標記物相比，它具有更高的敏感性用于檢測卵巢癌，特別是Ⅰ期［9，13］，而 HE4 編碼基因WFDC2表達是特別在漿液性和子宮內(nèi)膜樣卵巢癌［14，15］。然而，研究證明它還表示在其他一些類型的腫瘤，例如肺腺癌［15］。其表達也很明顯在正常子宮內(nèi)膜腺體和子宮內(nèi)膜癌［14，15］，但在子宮內(nèi)膜異位病灶包括卵巢子宮內(nèi)膜異位表達是不知道。

在本研究中，我們測量血清HE4和CA125濃度在129例內(nèi)膜異位癥患者其中70個有卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫。獲得的結(jié)果的數(shù)據(jù)與17例子宮內(nèi)膜癌患者，15例卵巢癌和67例健康對照患者進行比較。mRNA表達的編碼基因HE4和CA125，即WFDC2和MUC16，分別在不同類型的子宮內(nèi)膜異位、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和正常子宮內(nèi)膜的組織標本進行了分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在佳木斯大學附屬第一醫(yī)院2011-12～2013-10的住院患者被納入研究。采樣前所有病人的書面知情同意已同意，并符合研究方案經(jīng)倫理。

婦女的血清樣本確診為子宮內(nèi)膜異位癥(Endo，n=130)，卵巢癌(OvCa，n=15)，或子宮內(nèi)膜癌(EmCa，n=17)被納入研究，以及健康對照67個樣本(CTRL)。卵巢子宮內(nèi)膜異位患者的血清樣品(OvEndo中，n=70，ASRM臨床分期3～4)被評價為在分析中一個單獨的組。該疾病是在腹腔鏡或剖腹探查確診，并通過組織病理學評估證實。本研究患者的描述列于表1。子宮內(nèi)膜異位癥患者根據(jù)美國生殖醫(yī)學協(xié)會(ASRM)標準進行了分期1～4期。卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌患者根據(jù)FIGO標準進行了分期［16］。在15例卵巢癌包括8例漿液性，3例黏液性，2例透明細胞，1例子宮內(nèi)膜樣和1例小細胞癌。四例卵巢癌是I期，其余11例為晚期Ⅱ～Ⅳ期。所有子宮內(nèi)膜癌是子宮內(nèi)膜樣腺癌。15例子宮內(nèi)膜癌癥僅限于子宮(Ⅰ～Ⅱ期)，而2例轉(zhuǎn)移盆腔淋巴結(jié)(III期)。對照受試者(n=67)進行了輸卵管絕育期間以確定排除子宮內(nèi)膜異位癥，子宮內(nèi)膜活檢排除子宮內(nèi)膜癌，腹腔鏡排除卵巢癌的可能。子宮內(nèi)膜異位癥，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌，和健康對照的平均年齡分別是31.6，63.5，60.2和38.6歲。

表1 患者描述包含在血清HE4和CA125的分析

WFDC2和MUC16的基因表達，分別編碼HE4和CA125蛋白，被評估于148例非卵巢子宮內(nèi)膜異位病灶，29例卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫，16例卵巢癌和15例子宮內(nèi)膜癌，64例子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜組織標本，和42例健康對照組的子宮內(nèi)膜組織標本。13例卵巢癌為漿液性，一個是子宮內(nèi)膜樣癌和一個為未分化。所有子宮內(nèi)膜癌是子宮內(nèi)膜樣腺癌。組織樣本采集在腹腔鏡或開腹手術。子宮內(nèi)膜活檢使用無菌Pipelle采樣器收集。所有組織樣品被快速冷凍并儲存在液氮中。

1.2 血清HE4和CA125分析

收集血清樣品于進入手術前，血清放置約非肝素化試管，保持30min后在室溫下，以3000rpm速度離心15min(800g)中。這些血清保存在-20℃或-80℃。人類附睪分泌蛋白E4和CA125的濃度，在血清樣品中通過ELISA分析(Fujirebio公司診斷公司，美國)根據(jù)制造商的指示進行分析。

1.3 表達分析

WFDC2和MUC16的基因表達水平作為我們研究的全基因組微陣列分析的一部分?？俁NA分離用Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)，其應用 RNeasy柱(Qiagen，美國)和DNA酶(無RNA酶的DNA酶組(Qiagen公司)或DNA酶I(Invitrogen)的)進一步純化處理。將RNA濃度測定用Nano-Drop ND-1000(賽默飛世爾科技，美國)和RNA質(zhì)量通過的Experion分析(Bio-Rad實驗室，美國)進行控制。所有微陣列分析的后續(xù)步驟均在Finnish的DNA微陣列中心利用Sentrix Human Illumina 6 V2 Expression BeadChips，其中包含了超過47000個已知基因，候選基因，和剪接變種。RNA樣品(300ng每件)用作模板用于制備雙鏈cDNA，然后生物素化cRNA使用Illumina RNA全預備擴增試劑盒(Ambion公司，美國)。將標記的cRNA純化和雜交到BeadChip芯片在55℃下保持16h，接著全基因組基因表達。雜交是與Cyanine3-鏈霉(GE Healthcare，Little Chalfont，UK)檢測和陣列進行掃描與Illumina BeadArray閱讀器。正?；臀㈥嚵袛?shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用統(tǒng)計軟件研發(fā)套件SPSS19進行。使用探針I(yè)LMN_1706612和ILMN_1799120為WFDC2的表達水平進行分析；使用探針I(yè)LMN_1736316為MUC16的表達水平進行分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用Tukey多重比較，進行了血清HE4和CA125濃度的單獨和組合的統(tǒng)計分析，以95%為明智的置信水平。HE4和CA125標記的分類能力，單獨和共同，使用二進制和多分類Logistic回歸模型交叉驗證進行了評估。在交叉驗證反過來每個樣品，而其他被保留用于測試模型。在95%特異性的敏感性和正確的概率(診斷符合率)被交叉計算驗證回歸模型。

2 結(jié)果

2.1 血清HE4和CA125的濃度

血清HE4平均濃度相似，低于70pM的限制值對于升高［9］在子宮內(nèi)膜異位癥患者(平均46.2pM)和健康對照組(39.5pM)，而不論該疾病分類或存在的卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫的分期(ASRM：Ⅰ期：46.6pM；Ⅱ期：45.9pM；Ⅲ期：43.5pM；Ⅳ期：46.6pM；OvEndo：47.0pM)。然而，在卵巢癌患者明顯增加的血清HE4濃度(1135.1pM)，子宮內(nèi)膜癌患者血清HE4濃度也顯著升高(98.3pM，P＜0.01)。HE4濃度在不同類型的卵巢癌的水平是最高的是漿液性(2022.5pM，n=8)，而在透明細胞癌也顯然升高(387.5 pM，n=2)和黏液癌也顯著升高(212.3pM，n=3)。不同患者群體血清濃度見表2。

表2 血清HE4和CA125的濃度在患者的子宮內(nèi)膜異位癥，子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌

CA125血清水平在卵巢癌患者最高(平均1127.3umol/L，P＜0.01)，但也顯著(P＜0.01)升高在卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者(45.3umol/L)和高級非卵巢子宮內(nèi)膜異位癥(ASRM第Ⅳ期，41.2umol/L)與健康對照組(8.7umol/L)進行比較。這些CA125濃度也高于正常界線值(35umol/L)。濃度的增加隨著子宮內(nèi)膜異位癥的增加ASRM分期而升高，見表2。然而，子宮內(nèi)膜異位癥患者 CA125中位數(shù)濃度(33.7umol/L)是低于CA125正常界線值。子宮內(nèi)膜癌患者血清CA125水平(21.0umol/L)也顯著(P＜0.05)明顯高于健康對照組，即使偏低于正常界線值。

HE4，CA125，或它們聯(lián)合應用兩兩比較計算95%特異性的敏感性。區(qū)分卵巢癌患者與健康對照，CA125和HE4聯(lián)合相對于CA125或HE4單獨的診斷符合率最高(96.4%)和敏感性最高(93.9%)，見表3。此外，該聯(lián)合具有最高的診斷符合率(93.8%)和敏感性(79.6%)也用于卵巢子宮內(nèi)膜異位癥和卵巢癌的鑒別診斷。該聯(lián)合也區(qū)分卵巢子宮內(nèi)膜異位癥與健康對照，并幾乎盡與單獨CA125準確，即使HE4單獨是一個不太好對于宮內(nèi)膜異位癥。最后，HE4和CA125的聯(lián)合具有最高的準確度(82.9%)對于卵巢癌，卵巢子宮內(nèi)膜異位癥，和健康對照組之間的比較。

2.2 HE4和CA125編碼基因的表達

WFDC2(編碼HE4)和MUC16(編碼CA125)的組織樣品中的mRNA表達水平見表4。卵巢癌的表達與卵巢子宮內(nèi)膜異位比較，而子宮內(nèi)膜癌和非卵巢子宮內(nèi)膜異位病灶的表達與健康對照組正常子宮內(nèi)膜進行比較。WFDC2的表達顯著(P＜0.05)在卵巢癌(中位數(shù)的LOG2強度值9.25)比在卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫(6.63)與5.8倍的變化(FC)。然而，當與健康的子宮內(nèi)膜(7.87)相比，子宮內(nèi)膜癌(8.72)的1.9倍的高表達沒有達到統(tǒng)計學意義。因此，表達數(shù)據(jù)在用在不同的病人組和對照觀察HE4差分血清濃度線。與此相反，MUC16的mRNA表達水平在各樣品相對穩(wěn)定的，而所有的比較之間的FC是0.7～1.3。

表3 腫瘤標志物準確度和敏感性在95%的特異性對于卵巢癌和卵巢子宮內(nèi)膜異位癥

表4 WFDC2(HE4)和MUC16(CA125)的mRNA表達在子宮內(nèi)膜，非卵巢和卵巢子宮內(nèi)膜異位癥，子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌的組織標本為log2強度值

3 討論

HE4是一種新的血清學標志物尤其是卵巢癌診斷中使用了［8，9，17］。因為它的高敏感性，它也有用對于檢測 I期卵巢癌［9，13］。此外，HE4已被建議作為一種生物標志物為子宮內(nèi)膜癌的診斷［18］。目前，幾種生物標志物板被評估，以增加卵巢癌診斷的敏感性和特異性。CA125和HE4聯(lián)或不聯(lián)合其他生物標志物如 Glycodelin，Plau-R，MUC-1，PAI-1［13］，SMRP［9，17］，CA72-4，和骨橋蛋白［9］進行了評估，以改善卵巢癌的診斷。該數(shù)據(jù)表明，通過組合這些標志物的預測準確性在卵巢惡性腫瘤是比單獨應用任何標志物的更好。生物標志物包括HE4的板已經(jīng)評價也用于監(jiān)測卵巢癌的復發(fā)［13，19］。

在女性組織，HE4免疫反應已經(jīng)被證明是表達最高在生殖道，包括宮頸腺體，子宮內(nèi)膜腺體，輸卵管和前庭大腺腺上皮［14，15］。相反，正常卵巢表面上皮，其不表達 HE4，由化生苗勒管上皮內(nèi)襯皮質(zhì)包涵囊腫已顯示大量表達的蛋白質(zhì)［14］。HE4蛋白在卵巢腫瘤中的表達最高的是漿液性癌，但免疫組化檢測到在絕大多數(shù)的卵巢子宮內(nèi)膜樣和透明細胞癌［14，15］。除了卵巢癌，一些肺、子宮內(nèi)膜和乳腺腺癌已經(jīng)顯示出表達HE4［15］。雖然蛋白質(zhì)已經(jīng)在正常和惡性子宮內(nèi)膜被檢測到，HE4在子宮內(nèi)膜異位病灶的表達只是表面上已知的。近日，分析HE4在166例卵巢癌與其他幾種盆腔腫塊，其中29例有子宮內(nèi)膜異位癥［9］。它們表明，HE4和CA125的聯(lián)合是其他生物標記物中區(qū)分卵巢癌患者從那些與其他盆腔腫塊的最佳組合。然而，子宮內(nèi)膜異位病變的種類并沒有說明。

與其他最近的研究結(jié)果相一致［8，9，18，20］，我們發(fā)現(xiàn) HE4濃度升高在卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌的患者。本數(shù)據(jù)表明，不論HE4編碼基因在子宮內(nèi)膜異位病灶或是血清HE4濃度在子宮內(nèi)膜異位癥患者的任何類型的子宮內(nèi)膜異位癥不表達增加。而HE4甚至沒有在患者的卵巢子宮內(nèi)膜異位癥增加。相反，CA125血清水平在晚期子宮內(nèi)膜異位癥和卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫增加，符合預期。應當指出的是子宮內(nèi)膜異位癥診斷通常是在年輕成年(25～35歲)和常在絕經(jīng)后消失，而卵巢癌的發(fā)生率增加于老年婦女(在50～60歲的年齡發(fā)病率最高)。有趣的是，已經(jīng)報道，HE4的濃度隨著年齡的增大在健康的絕經(jīng)后婦女，而CA125不是［21］。因此，同時測量HE4和CA125，而不是單獨的其中之一，給予卵巢癌患者和健康人卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫的鑒別診斷更準確的工具。它也可以幫助臨床醫(yī)生在隨訪的患者晚期患子宮內(nèi)膜異位考慮到病變惡變的可能性。在超聲檢測卵巢腫塊的患者，血清HE4與CA125同時升高提示卵巢癌的存在，而CA125升高但HE4不升高將認為晚期卵巢子宮內(nèi)膜異位或其他良性疾病。此外，升高的血清HE4濃度與正常的CA125濃度認為卵巢癌或可能其它類型癌癥的存在，例如子宮內(nèi)膜癌。

卵巢癌和子宮內(nèi)膜異位癥之間的高度特異性分化的最大好處可能在發(fā)現(xiàn)在早期非癥狀期的卵巢癌。卵巢癌大部分被確診在晚期，并具有非常低的生存率。與此相反，I期疾病局限于卵巢的患者5年存活率為90%以上。這強調(diào)了檢測卵巢癌在早期階段以降低死亡率的重要性。

總之，HE4血清濃度是一種新型的生物標志物用于卵巢癌，在患者的卵巢子宮內(nèi)膜異位或任何其他類型的子宮內(nèi)膜異位癥沒有升高，而血清CA125濃度在晚期子宮內(nèi)膜異位癥增加。因此，血清HE4濃度是一個有價值的指標，以更好地鑒別卵巢惡性腫瘤與那些來自良性卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者。

［1］Giudice L，Kao L.Endometriosis［J］.Lancet，2004，364：1789 1799

［2］Nisolle M，Donnez J.Peritoneal endometriosis，ovarian endometrio-sis，and adenomyotic nodulesof the rectovaginal septum are three different entities［J］.Fertil Steril，1997，68：585 596

［3］Nagle C，Olsen C，Webb P，et al.Endometrioid and clear cell ovarian cancers：a comparative analysis of risk factors［J］.Eur JCancer，2008，44：2477 2484

［4］Sato N，Tsunoda H，Nishida M，et al.Loss of heterozygosity on 10q23.3 and mutation of the tumor suppressor gene PTEN in benign endometrial cyst of the ovary：possible sequence progression from benign endometrial cyst to endometrioid carcinoma and clear cell carcinoma of the ovary［J］.Cancer Res，2000，60：7052 7056

［5］Ness R.Endometriosis and ovarian cancer：thoughtson shared pathophysiology［J］.Am JObstet Gynecol，2003，189：280 294

［6］Markman M.The role of CA-125 in the management of ovarian cancer［J］.Oncologist，1997，2：6 9

［7］Terry K，Sluss P，Skates S，et al.Blood and urinemarkers for ovarian cancer：a comprehensive review［J］.Dis Markers，2004，20：53 70

［8］Hellstrom I，Raycraft J，Hayden-Ledbetter M，et al.The HE4(WFDC2)protein is a biomarker for ovarian carcinoma［J］.Cancer Res，2003，63：3695 3700

［9］Moore R，Brown A，Miller M，etal.The use ofmultiple novel tumor biomarkers for the detection of ovarian carcinoma in patients with a pelvicmass［J］.Gynecol Oncol，2008，108：402 408

［10］Mol B，Bayram N，Lijmer J，et al.The performance of CA-125 measurement in the detection of endometriosis：a meta-analysis［J］.Fertil Steril，1998，70：1101 1108

［11］Kitawaki J，Ishihara H，Koshiba H，et al.Usefulness and limits of CA-125 in diagnosis of endometriosis without associated ovarian endometriomas［J］.Hum Reprod，2005，20：1999 2003

［12］Seeber B，SammelM，F(xiàn)an X，etal.Panel ofmarkers can accurately predict endometriosis in a subset of patients［J］.Fertil Steril，2008，89：1073 1081

［13］Havrilesky L，Whitehead C，Rubatt J，et al.Evaluation of biomarker panels for early stage ovarian cancer detection and monitoring for disease recurrence［J］.Gynecol Oncol，2008，110：374 382

［14］Drapkin R，Von Horsten H，Lin Y，etal.Human epididymis protein 4(HE4)is a secreted glycoprotein that is overexpressed by serous and endometrioid ovarian carcinomas［J］.Cancer Res，2005，65：2162 2169

［15］Galgano M，Hampton G，F(xiàn)rierson HJ.Comprehensive analysis of HE4 expression in normal and malignant human tissues［J］.Mod Pathol，2006，19：847 853

［16］Benedet JL，Bender H，Jones H，et al.FIGO staging classifications and clinical practice guidelines in the management of gynecologic cancers，F(xiàn)IGO Committee on Gynecologic Oncology［J］.Int J Gynaecol Obstet，2000，70：209 262

［17］Hellstrm I，Hellstrom K.SMRP and HE4 as biomarkers for ovarian carcinoma when used alone and in combination with CA125 and/or each other［J］.Adv Exp Med Biol，2008，622：15 21

［18］Moore R，Brown A，Miller M，et al.Utility of a novel serum tumor biomarker HE4 in patients with endometrioid adenocarcinoma of the uterus［J］.Gynecol Oncol，2008，110：196 201

［19］Moore R，McMeekin D，Brown A，et al.A novelmultiple marker bioassay utilizing HE4 and CA125 for the prediction of ovarian cancer in patientswith a pelvicmass［J］.Gynecol Oncol，2009，112：40 46

［20］Gagnon A，Ye B.Discovery and application of protein biomarkers for ovarian cancer［J］.Curr Opin Obstet Gynecol，2008，20：9 13

［21］Lowe KA，Shah C，Wallace E，etal.Effectsof personal characteristics on serum CA125，mesothelin，and HE4 levels in healthy postmenopausal women at high-risk for ovarian cancer［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2008，17：2480 2487