李培育，和 梅，左寒璐

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003)

茵陳蒿［1，2］為多年生草本艾科植物，目前對(duì)其治療腦出血具體機(jī)制方面的研究報(bào)道很少。腫瘤壞死因子 α［3～5］(Tumor necrosis factor TNF-a)各種病因所致腦水腫均可觀察到TNF-a的過度表達(dá)。腦出血時(shí)局部腦組織釋放促凝血酶原激酶，激活補(bǔ)體的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，生成C5a，在C5a存在的情況下，巨噬細(xì)胞被激活產(chǎn)生TNF-a。細(xì)胞因子中白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1βIL-1β)是一種重要的炎性細(xì)胞因子，IL-1β［6，7］可能參與了缺血性腦損傷引起的神經(jīng)元的死亡，在缺血性病理損傷中起重要的作用。其可以通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞黏附分子，使白細(xì)胞聚集在缺血腦組織，加重腦組織損害。本文旨在研究茵陳蒿水提液對(duì)腦出血模型大鼠腦出血周圍組織IL-1β、TNF-a的表達(dá)的影響，為茵陳蒿提取液在臨床的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，讓其更廣泛地應(yīng)用于腦出血患者。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

純系Wistar大鼠100只，雌性50只，雄性50只，2～3月齡，體重200～250g，由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)中藥

茵陳蒿由藥店采購(gòu)，經(jīng)鑒定符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。RT-PCR試劑盒(大連寶生物有限公司)；TNF-a免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；IL-1β免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將100只Wistar大鼠隨機(jī)分成4組，即正常對(duì)照組、創(chuàng)傷模型組、低劑量組(50mg/kg·d)、高劑量組(150mg/kg·d)，參照 Rosenberg等［8］報(bào)道的方法采用注射膠原酶Ⅶ造模。模型成功判斷按Bederson［42］的評(píng)定方法分成三級(jí)，具體為：I級(jí)：將大鼠尾巴提起癱瘓側(cè)前肢回收屈曲于腹下，正常側(cè)前肢向地面伸展；Ⅱ級(jí)：除I級(jí)體征外向癱瘓側(cè)推大鼠時(shí)阻力較對(duì)側(cè)明顯降低；Ⅲ級(jí)：除以上體征外大鼠有向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)的行為。茵陳蒿水提液高、低劑量組于造模后立即灌胃給藥。高劑量組0.1mL/g·d，低劑量組0.05mL/g·d，均每日分兩次灌服，用藥到相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)。ICH對(duì)照組：造模后立即灌服等體積生理鹽水，與用藥組時(shí)間相同。于造模成功后1d、3d、7d分時(shí)間點(diǎn)處死，取動(dòng)物出血部位腦組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.4 檢測(cè)方法

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織TNF-a、IL-1β，按試劑盒說明書操作。用β-actin作為內(nèi)參。按照按PCR試劑盒說明操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，進(jìn)行方差分析、組間差異性檢驗(yàn)用q檢驗(yàn)。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。

2 結(jié)果

2.1 IL-1β免疫組化結(jié)果

見表1。

表1 各組間不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β顯色指數(shù)()

表1 各組間不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β顯色指數(shù)()

注：各組與正常組比*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。與模型組相比#P＜0.05，與模型組相比## P＜0.01，與低劑量組相比＆P＜0.05

組別1d 3d 7d正常組6.63±0.31 8.26±0.22 4.32±0.12模型組 92.33±3.52＊＊ 84.26±2.71＊＊ 70.43±3.35*低劑量組 84.54±4.13＊＊ 74.63±3.15* 60.54±2.53*#高劑量組 77.37±3.72* 54.65±3.28*# 35.55±2.02＊＊##＆

治療1d后正常對(duì)照組比較模型組IL-1β免疫組織化學(xué)顯色指數(shù)明顯升高(P＜0.01)；高劑量組低劑量組顯色指數(shù)與模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。治療3d后正常對(duì)照組比較模型組IL-1β免疫組織化學(xué)顯色指數(shù)明顯升高(P＜0.01)，治療高、低劑量組IL-1β顯色指數(shù)明顯低于模型組(P＜0.05)，高、低劑量組之間無顯色指數(shù)無差異(P＞0.05)；治療7d后正常對(duì)照組比較模型組IL-1β免疫組織化學(xué)顯色指數(shù)明顯升高(P＜0.01)，治療高、低劑量組IL-1β顯色指數(shù)明顯低于模型組(P＜0.05或P＜0.01)，高劑量組IL-1β顯色指數(shù)明顯低于低劑量組(P＜0.05)。

2.2 TNF-a免疫組化結(jié)果

見表2。

表2 各組間TNF-a顯色指數(shù)比較(x± s，%)

治療1d后正常對(duì)照組比較模型組TNF-a免疫組織化學(xué)顯色指數(shù)明顯升高(P＜0.01)；高劑量組、低劑量組顯色指數(shù)與模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。治療3d后正常對(duì)照組比較模型組TNF-a免疫組織化學(xué)顯色指數(shù)明顯升高(P＜0.01)，治療高、低劑量組TNF-a顯色指數(shù)明顯低于模型組(P＜0.05)，高、低劑量組之間無顯色指數(shù)無差異(P＞0.05)。

2.3 RT-PCR結(jié)果

2.3.1 茵陳蒿水提液對(duì)大鼠血腫周圍腦組織IL-1βmRNA表達(dá)的結(jié)果，見表3。

表3 茵陳蒿水提液對(duì)大鼠血腫周圍腦組織IL-1βmRNA表達(dá)的影響(n=8)

治療1d后腦出血模型組大鼠腦血腫周圍組織IL-1β mRNA表達(dá)水平比正常對(duì)照組明顯增多，茵陳蒿水提液高劑量組、低劑量組大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達(dá)水平較模型組無明顯差異，結(jié)果無著性意義。治療3d后腦出血模型組大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達(dá)水平比正常對(duì)照組明顯增多，茵陳蒿水提液高劑量組、低劑量組大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達(dá)水平較模型組下調(diào)，差異有極顯著性意義(P＜0.05)。提示茵陳蒿水提液高、低劑量在治療3d后可降低大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達(dá)。治療7d后茵陳蒿水提液高劑量組、低劑量組大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達(dá)水平較模型組下調(diào)，差異有極顯著性意義(P＜0.05或P＜0.01)。提示茵陳蒿水提液高、低劑量在治療7d后可降低大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達(dá)。

2.3.2 茵陳蒿水提液對(duì)大鼠血腫周圍腦組織TNF-αmRNA表達(dá)的結(jié)果，見表4。

表4 茵陳蒿水提液對(duì)大鼠血腫周圍腦組織TNF-αmRNA表達(dá)的影響(n=8)

治療1d后腦出血模型組大鼠腦血腫周圍組織TNF-α mRNA表達(dá)水平比正常對(duì)照組明顯增多，茵陳蒿水提液高劑量組、低劑量組大鼠腦血腫周圍組織TNF-αmRNA表達(dá)水平較模型組無明顯差異，結(jié)果無著性意義。治療3d后茵陳蒿水提液高劑量組、低劑量組大鼠腦血腫周圍組織TNF-α mRNA表達(dá)水平較模型組下調(diào)，結(jié)果有著性意義(P＜0.05)。高劑量組與低劑量組TNF-αmRNA表達(dá)無顯著意義。治療7d后茵陳蒿水提液高劑量組、低劑量組大鼠腦血腫周圍組織TNF-αmRNA表達(dá)水平較模型組下調(diào)，差異有極顯著性意義(P＜0.05或P＜0.01)。提示茵陳蒿水提液高、低劑量在治療7d后可降低大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達(dá)。茵陳蒿水提液高劑量組IL-1βmRNA表達(dá)較低劑量下調(diào)，差異有顯著意義(P＜0.05)。

3 討論

在腦出血中，炎癥反應(yīng)是其中的重要環(huán)節(jié)，在引起腦血腫占位效應(yīng)的同時(shí)還可以繼發(fā)破壞周圍組織。引起一系列反應(yīng)進(jìn)而加重組織損害。IL-1β炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，它是由腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的炎癥細(xì)胞激活腦神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，它可以激活過釋放脂源性介質(zhì)促進(jìn)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生氧自由基，用來破壞神經(jīng)元的細(xì)胞膜加重腦組織壞死，同時(shí)IL-1β能釋放大量毒性產(chǎn)物和破壞性蛋白酶，致使神經(jīng)細(xì)胞遭到損害［9，10］。

TNF-α是一種炎癥前體細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中起著重要作用［11］。它可以促進(jìn)IL-1分泌，還能促進(jìn)白細(xì)胞分泌，同時(shí)參與炎癥損傷的過程，TNF-α、IL-1β也可誘導(dǎo)趨化因子(chemokines)表達(dá)“趨化因子可直接或間接誘導(dǎo)另一些細(xì)胞的活動(dòng)，為炎癥細(xì)胞直接進(jìn)入損傷組織提供化學(xué)梯度”，加重炎癥反應(yīng)，破壞腦組織。

在本實(shí)驗(yàn)中，造模后1d模型組大鼠腦血腫周圍組織的TNF-α、IL-1β免疫組化顯色指數(shù)均較正常對(duì)照組明顯上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)；模型組大鼠腦血腫周圍組織TNF-α、IL-1β的 mRNA表達(dá)也均較正常組上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)。

從以上結(jié)果表明，茵陳蒿水提液可以對(duì)腦出血的大鼠有一定的治療作用，其可能的的機(jī)制為抑制IL-1β、TNF-α的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)，減小對(duì)腦組織的傷害來實(shí)現(xiàn)，在治療的3d后高劑量組和低劑量組IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白表達(dá)無明顯差異性(P＞0.05)。隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)，治療7d后高劑量組IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白表達(dá)較模型、正常組、低劑量組明顯增高。因此可以說明隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，茵陳蒿水提液高劑量的治療效果較低劑量效果要好。

［1］中華人民共和國(guó)藥典2000年版一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000，192

［2］陰健.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用［M］.北京：學(xué)苑出版社，1995，484

［3］Kim JS.Cytokines and adhesion molecules in stroke and related diseases［J］.JNeurol Sci，1996，137(2)：69 78

［4］Frijns CJ，Kapplle LJ，Van Gijn J，et al.Soluble adhesion molecule Reflect endothelial cell aetiation in ischemie stroke and in carotid atheroselerosis［J］.Stroke，1997，28(2)：2214 2218

［5］Kimelberg HK.Current concepts of brained ema.Review of laboratory investigations［J］.JNeurosugr，2011，83(6)：1051 1059

［6］Rosengar TK，LeeLPatel SR.Angiogenesis gene therapy：phase Iassessment of direct intramyocardialadministration of an adenovirus vector expressing VEGF 121 cDNA to individuals with clinically significant severe coronary disease［J］.Circulation，1999，100：468 474

［7］Wang Rq，Zhu XZ.Expression of angiopoietin-2 and vascular endothelial growth factor inmice cerebral cortex after permanent focal cerebral ischemial［J］.Acta Pharmacol Sin，2002，23(51)：405 411

［8］Ddard-Fineglod.Moderate Hyperlgcernia worsene AcuteBlood Brain Barrier injury after forebrain ischemia in rats［J］.Res，1984，18(1)：7

［9］Barone FC，F(xiàn)euerstein GZ.Inflammatory mediators and stroke：new opportunities for novel therapeutics［J］.JCereb Blood Flow Metab，1999，19：819 834

［10］Bestue-Cardiel M，Martin-Martinez J，Iturriaga-Heras C，et al.Leukocytes and primary intracerebral hemorrhage［J］.Rev Neurol，1999，29：968 971

［11］Gong C，Hoff JT，Keep RF.Acute inflammatory reaction following experimental intracerebral hemorrhage in rat［J］.Brain Res，2000，871：57 65