段翠翠，王慶國，王為光，鮑瑩瑩，張 純

（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯154003）

白血病是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重危害著人類的健康。我國白血病發(fā)病率為2.76／10萬。在惡性腫瘤死亡率中，白血病居第6位（男性）和第8位（女性）［1］。它同實(shí)體腫瘤一樣，腫瘤細(xì)胞的過度增殖和凋亡受抑制是其發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制［2］。凋亡抑制蛋白（IAP）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類蛋白家族，其可以對(duì)抗各種凋亡誘導(dǎo)因素的作用，抑制細(xì)胞凋亡，與腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。至今為止人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了8個(gè)IAP家族成員，研究發(fā)現(xiàn)它的抗凋亡能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過于Bc1-2家族，在腫瘤疾病的發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用［3］，而XIAP的生物學(xué)機(jī)制及結(jié)構(gòu)是IAP家族中研究最為明確的凋亡抑制蛋白［4］，而且其在該家族中被認(rèn)為是最強(qiáng)、最有效的Caspase抑制物。Caspase-3是重要的凋亡執(zhí)行者之一，在細(xì)胞凋亡過程中處于中心地位，是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)因子［5，6］，Caspase-3被激活后能裂解大量的底物，包括抗凋亡成分及結(jié)構(gòu)蛋白等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，在腫瘤的發(fā)生中起著重要的作用。本研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)方法，檢測(cè)AL患者及健康成人骨髓細(xì)胞中XIAP、Caspase-3 mRNA的表達(dá)，探討XIAP及Caspase-3在AL發(fā)生、發(fā)展過程中的作用以及二者相關(guān)性，為臨床診療與預(yù)后提供有價(jià)值的參考指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 病例組（AL組）：AL患者50例均系在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科自2012-03～2013-06住院治療患者，男24例，女26例，年齡18～74歲，中位年齡48歲。包括初治32例，其中急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）10例，急性髓細(xì)胞白血病（AML）22例；復(fù)發(fā)18例，其中ALL7例，AML 11例，AL患者均接受兩個(gè)正規(guī)療程化療后，以骨髓緩解率作為療效的判斷標(biāo)準(zhǔn)。以上病人的診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)均參照張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》［7］。

1.1.2 對(duì)照組（N組）：選取佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診健康體檢的成人共30例，男18例，女12例，年齡26～58歲，中位年齡47歲。

1.2 單個(gè)核細(xì)胞分離及總RNA提取

無菌操作采集白血病患者骨髓液2m L后肝素抗凝。用人淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll-Paque PREMIMU，密度為1.077g／m L，上海新睿生物科技有限公司）2m L，以2 000r／min離心15min，分離單個(gè)核細(xì)胞。然后應(yīng)用PBS液洗滌5×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，加入0.8mL Trizol液 （Invitrogen公司），混勻后在-80℃下保存。所有操作要嚴(yán)格按照Invitrogen公司的試劑盒的說明書進(jìn)行，提取上述單個(gè)核細(xì)胞中的總RNA，RNA的完整性采用變性凝膠電泳檢測(cè)，并使用Beckman DU640蛋白核酸分析儀進(jìn)行RNA濃度和純度（A260／A280的值在1.8～2.0）的檢測(cè)。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄、聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）分析

1.3.1 逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司，Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用752型紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm的吸收值來確定RNA的含量，以O(shè)D260相當(dāng)于40Lg RNA來計(jì)算RNA的產(chǎn)率，OD260在1.8～2.0時(shí)可以認(rèn)為提取的RNA純度很高。RT-PCR采用一步法，按操作手冊(cè)進(jìn)行。內(nèi)參照β-action及PCR引物都是由上海生工生物技術(shù)有限公司提供的。RT-PCR反應(yīng)條件：cDNA合成和預(yù)變性1個(gè)循環(huán)：39℃15min，94℃2min；PCR擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)：94℃15s，59℃30s，72℃1min，終延伸1個(gè)循環(huán)72℃10min。制備1.7%瓊脂糖凝膠，取10μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，在紫外燈下進(jìn)行拍照，并采用天能全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照并進(jìn)行灰度掃描分析，通過比較電泳條帶的光密度值，獲得Caspase-3及XIAP m RNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。

1.3.2 引物的序列XIAP：XIAP上游引物：5'-CCGTGCGGTGCTTTAGTTGTC-3'，下 游 引 物：5'-ATGGCAGGGTTCCTCGGGTAT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為301 bp；Caspase-3引物：上游5'TGTCGATGCAGCAAACCTCA 3'，下游5'TTTCAGCATGGCACAAAGCG 3'，擴(kuò)增產(chǎn)物469 bp；以β-actin作為內(nèi)參照，其上游引物5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為205 bp。

1.3.3 PCR產(chǎn)物分析取10m L擴(kuò)增產(chǎn)物與2μL 6×Loading Buffer混合后在1.7%瓊脂糖凝膠中120V電泳30min。急性白血病初治組、和復(fù)發(fā)組及對(duì)照組在205bp和301bp處均可見一條亮帶，分別為β-actin和XIAP m RNA；在469 bp處為Caspase-3 mRNA。應(yīng)用紫外線透射儀觀察并且拍照，經(jīng)Metamorph ImagingSight軟件進(jìn)行分析并且讀取光密度值，取XIAP mRNA／B-actin、Caspase-3 m RNA／β-actin光密度比值進(jìn)行半定量分析，各標(biāo)本重復(fù)3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。XIAP、Caspase-3的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)進(jìn)行相關(guān)分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AL組XIAP及Caspase-3的表達(dá)

AL組病人與對(duì)照組病人均表達(dá)不同水平的XIAP及Caspase-3，見圖1、圖2。AL組XIAP的表達(dá)水平為（0.679±0.132），明顯高于對(duì)照組（0.486±0.059），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；AL組Caspase-3的表達(dá)水平為（0.178±0.057），明顯高于對(duì)照組（0.369±0.062），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。兩者呈負(fù)相關(guān) （r=-0.837，P＜0.05）。而ALL與AML病人XIAP及Caspase-3表達(dá)水平差異無顯著性 （P＞0.05）。

（M：Marker；1對(duì)照組；2、3：初治 AL組；4、5：復(fù)發(fā) AL組）圖1 XIAP基因RT-PCR檢測(cè)

（M：Marker；1：對(duì)照；2、3：初治 AL；4、5：復(fù)發(fā) AL）圖2 Caspase-3基因RT-PCR 檢測(cè)

2.2 XIAP和Caspase-3在初治AL組和復(fù)發(fā)AL組中的表達(dá)

XIAP在初治AL組的表達(dá)水平分別為（0.596±0.031），明顯低于復(fù)發(fā)AL組（0.828±0.107）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Caspase-3在初治AL組的表達(dá)水平分別為（0.207±0.043），明顯高于復(fù)發(fā) AL組（0.126±0.039）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 XIAP及Caspase-3的表達(dá)與患者臨床療效的關(guān)系

根據(jù)急性白血病初治組XIAP及Caspase-3的表達(dá)水平 （χ1=0.596；χ2=0.206）將其分為高、低表達(dá)組（XIAP／β-actin≥0.596為高表達(dá)，＜0.596為低表達(dá)；Caspase-3／β-actin≥0.206為高表達(dá)，＜0.206為低表達(dá)）。XIAP高表達(dá)組經(jīng)過正規(guī)治療兩個(gè)療程完全緩解率為26.7%（4／15），而XIAP低表達(dá)組完全緩解率為64.7%（11／17），兩者比較差異有顯著性（χ21=4.630，P＜0.05）；Caspase-3高表達(dá)組經(jīng)過正規(guī)治療兩個(gè)療程完全緩解率為68.8%（11／16），而Caspase-3低表達(dá)組完全緩解率為25.0%（4／16），兩者比較差異有顯著性 （χ22=6.149，P＜0.05）。

3 討論

腫瘤細(xì)胞凋亡受抑在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)不同的凋亡途徑都是通過激活Caspase的完成的［8］。而Caspase-3被認(rèn)為是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最為重要的效應(yīng)酶，在凋亡途徑最后的執(zhí)行階段常常起到不可替代的核心作用，其被稱為凋亡的”執(zhí)行者”［9］。鑒于Caspase-3在凋亡中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，它已經(jīng)成為了近幾年凋亡研究的熱點(diǎn)。

XIAP系分子結(jié)構(gòu)研究得最清楚的凋亡抑制蛋白IAP家族的一員，它是內(nèi)源性凋亡抑制蛋基因家族中最有效的Caspase抑制劑［11］，大量研究表明，XIAP在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)水平顯著高于正常組織，提示其過度表達(dá)可以抑制多種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)XIAP可以通過其BIR2、BIR3分別抑制Caspase-3、Caspase-7的活性及Caspase-9的活性及環(huán)指結(jié)構(gòu)域泛素降解Caspases等多種途徑而發(fā)揮抗凋亡作用。

本研究證實(shí)，在急性白血病患者骨髓液中XIAP m RNA的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，caspase-3 mRNA的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明二者在AL的發(fā)生發(fā)展中關(guān)系密切，二者可能是白血病細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的最重要的環(huán)節(jié)之一。并且發(fā)現(xiàn)XIAP和Caspase-3的表達(dá)具有負(fù)相關(guān)性，二者經(jīng)Spearman相關(guān)分析顯示r=-0.837，P＜0.05。AL初治組XIAP的表達(dá)水平低于復(fù)發(fā)組XIAP表達(dá)水平（P＜0.05）；AL初治組Caspase-3的表達(dá)水平高于復(fù)發(fā)組Caspase-3表達(dá)水平，而且XIAP高表達(dá)組經(jīng)過兩個(gè)正規(guī)療程化療后完全緩解（CR）率低于低表達(dá)組（P＜0.05），Caspase-3高表達(dá)組的完全緩解率高于低表達(dá)組（P＜0.05），提示二者的表達(dá)與化療藥物的敏感性有一定的聯(lián)系，XIAP的高表達(dá)及Caspase-3低表達(dá)可能是導(dǎo)致急性白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物不敏感的原因之一。實(shí)驗(yàn)中ALL組與AML組比較，XIAP、Caspase-3表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示XIAP、Caspase-3與AL患者的臨床分型可能無關(guān)，這一結(jié)論尚有待于進(jìn)一步擴(kuò)大病例數(shù)繼續(xù)研究。因此，XIAP、Caspase-3可能參與了急性白血病的發(fā)生發(fā)展，可為急性白血病的臨床診療與預(yù)后提供有價(jià)值的參考指標(biāo)。

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