單 鶴，陸曉紅，王國輝，劉 蕾，金玉玲

（佳木斯大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)一科，黑龍江 佳木斯154003）

近年研究發(fā)現(xiàn)PPARγ受體與神經(jīng)細胞的炎癥和氧化應激有關，目前對其研究主要集中在急性腦缺血再灌注早期對神經(jīng)系統(tǒng)的作用，本實驗以戊四氮致癇大鼠為研究對象擬研究PPARγ受體表達變化在神經(jīng)細胞損傷中的影響。

1.1 實驗動物及分組

健康體重（180±10）g雄性SD大鼠，共40只（由大連醫(yī)科大學動物實驗中心提供動物質(zhì)量合格證號：20131853P）。隨機分為正常組，PTZ組（P）。

1.2 動物模型建立

上述5組動物除對照組外，均給予PTZ（35mg／kg，每日1次）腹腔注射，參照Morgan等的方法并略加改動［1］。PTZ用前以生理鹽水新鮮配制成溶液（10g／L）。每天1次，持續(xù)28d；停藥1周，再用相同劑量的PTZ腹腔注射測試。正常組給予等體積的生理鹽水。

1.3 大鼠行為學觀察

各組大鼠每日經(jīng)上述處置后，均參考Racine［2］為觀察行為變化的分級標準。癲癇大鼠發(fā)作的行為學變化的分級標準為：0級：正常行為狀態(tài)；Ⅰ級：咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉的抽搐，濕狗樣顫動；Ⅱ級：以點頭運動為主要表現(xiàn)的頸部肌肉的抽搐；Ⅲ級：前肢的陣攣、抽搐；Ⅳ級：雙側(cè)前肢伸直，伴有身體的立起；Ⅴ級：跌倒和全身驚厥。Ⅲ級以下為復雜部分發(fā)作，Ⅳ級和Ⅴ級為全身強直陣攣發(fā)作。注藥后即進行行為學觀察，凡出現(xiàn)連續(xù)5次Ⅱ級或Ⅱ級以上驚厥發(fā)作的大鼠為達到點燃標準的模型。3只未達上述標準淘汰，2只死亡。

實驗結(jié)束后區(qū)全部大鼠給予10%水合氯醛深部麻醉于低溫下迅速取腦，以備后續(xù)實驗。

1.4 RT-PCR檢測海馬PPARγm RNA表達

海馬50mg，TRIzol法抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后PCR擴增，引物序列在NCBI基因庫中查找大鼠PPARγ序列，經(jīng)同源比對后確定PPARγ及β-actin的引物序列（PPARγ上游引物：5'-CAGGAGCAGAGCAAAGAGGT-3'；下游引物：5'GGCTCATATCTGTCTCCGTCT-3'，長度 583bp；β-actin：上游 引物 5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，下 游 引 物：5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'長度173bp，引物由上海生工公司合成。擴增反應條件：95℃預變性3min；95℃30s，退火溫度30s，60℃（PPARγ）／58℃（β-actin）30s，40個循環(huán)；72℃ 延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，凝膠成像儀成像。采用Quantity One凝膠圖像分析軟件分析結(jié)果，以PPARγ與，β-肌動蛋白（β-Actin）擴增產(chǎn)物光密度的比值反映表達水平。

1.5 尼氏染色海馬神經(jīng)元形態(tài)學觀察

制作石蠟切片，對切片進行神經(jīng)元尼氏染色觀察各組大鼠海馬神經(jīng)元存活狀態(tài)，神經(jīng)元細胞的排列情況。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，樣本均數(shù)間比較用方差分析，實驗結(jié)果以（）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 癲癇大鼠海馬組織PPARγm RNA水平的變化

在mRNA水平，PPARγ在戊四氮致癇大鼠海馬內(nèi)表達顯著低于正常組（P＜0.01），在慢性癲癇形成24h（0.93±0.038）PPARγmRNA 表達下降 （P＜0.05），并持續(xù)減少（48h：0.85±0.045，P＜0.05），至72h（0.76±0.015）僅見微量表達，具有顯著性（P＜0.05）。見圖1，表1。

圖1 不同組別大鼠視網(wǎng)膜PPARγm RNA表達

表1 不同組別大鼠海馬PPARγ／β-actin相對灰度值比較（）

表1 不同組別大鼠海馬PPARγ／β-actin相對灰度值比較（）

注：＊與正常組比較，P＜0.01；＃ 與PTZ后48h組比較，P＜0.05；＊＊ 與PTZ后72h組比較，P＜0.05。

組別 n PPARγ／β-actin正常組9 1.02±0.035 PTZ后24h組 11 0.93±0.038＊PTZ后48h組 9 0.85±0.045＃PTZ后72h組 6 0.76±0.015＃＊＊

2.2 尼氏染色

在對照組大鼠海馬區(qū)尼氏體清晰可見，排列整齊、規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，體積較大，尼氏體核仁明顯、胞漿豐富，軸突、樹突清晰可辨，膠質(zhì)細胞分散在海馬神經(jīng)元之間，呈星形或梭形，體積小、核圓形或卵圓形。癲癇各組大鼠海馬區(qū)部分尼氏胞體減少，結(jié)構(gòu)不清、胞漿減少，且著色淺，膠質(zhì)細胞體積增大，數(shù)量增多。見如圖2。

圖2 正常組、PTZ后24h、PTZ后48h、PTZ后72h尼氏染色（×10）

3 討論

癲癇至今尚無根治的辦法，因此癲癇的治療成為國內(nèi)外研究的重點。目前的研究發(fā)現(xiàn)認為：①癲癇異常放電過程可以引起大腦廣泛的神經(jīng)病理生理學變化。②海馬環(huán)路內(nèi)的軸突出芽及突觸重建是癲癇的主要的病理生理特征。近年來發(fā)現(xiàn)認為癲癇發(fā)作所引起的腦內(nèi)炎性反應是導致癲癇發(fā)作后腦組織病理改變，特別是海馬結(jié)構(gòu)損傷（包括海馬內(nèi)神經(jīng)元脫失、神經(jīng)元凋亡、膠質(zhì)細胞增生、纖維發(fā)芽、海馬硬化等）的主要原因之一，各種癲癇模型的動物實驗表明，癲癇的整個發(fā)病過程中都伴有免疫和炎癥反應［3］，癲癇發(fā)作后膠質(zhì)增生，結(jié)構(gòu)的紊亂，這一過程又進一步加重了興奮性病灶的形成，癲癇腦損傷既是癲癇發(fā)作的結(jié)果，又是癲癇頻發(fā)和難治的原因之一，有效控制癲癇發(fā)作、減少癲癇發(fā)作后神經(jīng)元損傷，對癲癇發(fā)病機制的研究具有重要的理論和臨床意義。

PPARγ（過氧化物酶體增殖物激活受體γ）在炎癥、動脈粥樣硬化、胰島素抵抗、糖代謝、腫瘤中有重要的調(diào)節(jié)作用。PPARγ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也有表達，激活PPARγ后促進神經(jīng)細胞的分化和成熟，并參與神經(jīng)細胞程序性死亡，近年研究也發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)元變性的致病機制與胰島素代謝及信號轉(zhuǎn)導相關［4］，既PPARγ的激活與神經(jīng)細胞的損傷和氧化應激有相關性，PPARγ通過抑制NF+-κ引發(fā)的下游炎癥級聯(lián)反應，其作為介導炎癥信號及相關細胞因子釋放的中心環(huán)節(jié)，以放大炎癥反應效應［5］。PARPγ可調(diào)節(jié)TNF-α、NOS等NF-kB依賴性的途徑，抑制PARPγ可以降低NF-kB介導的炎癥反應［6］。在大鼠腦缺血模型中使用PARPγ抑制劑可以降低由NF-k Bp65入核所介導的腦部炎癥損傷，并且通過這一抑制作用來降低NF-kBp65介導的炎癥相關因子的產(chǎn)生，最終減少梗死面積，改善卒中后炎性粒細胞的浸潤［7，8］。將神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞進行體外混合培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)PPARγ的配體能阻止脂多糖（LPS）誘發(fā)的神經(jīng)元損傷，提示PPARγ參與神經(jīng)保護作用，并且發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞也能表達PPARγ，其在小膠質(zhì)細胞上的表達受嚴格調(diào)節(jié)，并與小膠質(zhì)細胞的功能狀態(tài)有關，2006年有國外研究顯示，腦缺血后小膠質(zhì)細胞的激活抑制了PPARγ的表達，隨著炎癥的進一步發(fā)展，PPARγ的表達被激活的小膠質(zhì)細胞及其炎性介質(zhì)進一步下調(diào)。臨床研究也證實，PPARγ激動劑對有炎癥參與的神經(jīng)系統(tǒng)疾患如多發(fā)性硬化、阿爾茨海默病等具有抑制炎性分子如iNOS的釋放，抑制炎癥反應，改善患者的預后，提高患者的認知力作用［9］，另有研究表明在癲癇鼠模型中，PPARγ可抑制小膠質(zhì)細胞的活性，阻止癲癇后的炎癥反應，減少神經(jīng)細胞凋亡，起到神經(jīng)保護作用［10］。

本研究結(jié)果顯示，癲癇發(fā)作組大鼠海馬區(qū)中PPARγmRNA的表達較正常組減少，且隨著發(fā)作時間的延長PPARγm RNA的表達量逐漸減少，與對照組比較差異具有顯著性（P＜0.05），且不同時間點尼氏染色見正常組中尼氏體結(jié)構(gòu)完整、胞漿飽滿，軸突、樹突完整，而癲癇發(fā)作組尼氏體減少，結(jié)構(gòu)紊亂，膠質(zhì)細胞增多，這一過程可能與癲癇發(fā)作后NF-kb核移位所介導的一系列炎癥因子如IL-2釋放COX-2的表達［11］，進一步加重膠質(zhì)細胞增生，神經(jīng)元凋亡有關，本研究結(jié)果表明，PPARγ低表達可能是癲癇發(fā)作后神經(jīng)元炎癥損傷的潛在機制之一。

［1］Morgan JI，Cohen DR，Hempstead JL，et al.Mapping pattern of c-fos expression in the central nervous system after seizure［J］.Science，1987，237（4811）：192-197

［2］Racine RJ，Steingart M，McIntyre DC.Development of kindlingprone and kindling-resistant rats：selective breeding and electrophysiological studies［J］.Epilepsy Res，1999，35（3）：183-195

［3］劉淑華.戊四氮慢性致癇大鼠海馬區(qū)NF-k B、I-k BA動態(tài)表達及地塞米松的影響［J］.黑龍江醫(yī)藥科學，2006，29（2）：3-4

［4］De la Monte SM，Wands JR.Review of insulin and insulin-like growth factor expression，signaling，and malfunction in the central nervous system：relevance to Alzheimer＇s disease［J］.Alzheimer Dis，2005，7（1）：45-61

［5］聶晶，劉冬焱，李貞.LPS致早期新生大鼠腦白質(zhì)損傷時NF-KB表達與細胞凋亡的關系［J］.黑龍江醫(yī)藥科學，2011，34（1）：18-19

［6］Kauppinen TM.Multiple roles forpoly（ADP-ribose）polymerase-1 in neurological disease［J］.Neurochem，2007，50（7-8）：954-958

［7］ChiarugiA，Moskowitz MA.Poly（ADP-ribose）polymerase-1 activity promotes NF-kappa B-driven tran-scription and microglial activation：implication for neurodegenerative disorders［J］.Neurochem，2003，85（2）：306-317

［8］Koh SH，ChangDI，Kim HT，et al.Effect of3-aminobenzamide，PARP inhibitor，on matrix metalloproteinase-9 level in plasma and brain of ischemic stroke model［J］.Toxicology，2005，214（1-2）：131-139

［9］Sastre M，Klockgether T，Heneka MT，et al.Contribution of inflammatory processes to Alzheimer's disease：molecular mechanisms［J］.Dev Neurosci，2006，24（2-3）：167-176

［10］Sun H，Huang Y，Yu X，et al.Peroxisome proliferator activated receptor gammaagonist， rosiglitazone， suppresses CD40expression and attenuates inflammato-ry responses after lithium pilocarpine-induced statusepilepticus in rats［J］.Dev Neurosci，2008，26（5）：505-15

［11］王勝軍.PARP調(diào)節(jié)癲癇大鼠海馬核轉(zhuǎn)錄因子kB及相關炎癥因子的表達［J］.中國病理生理雜志，2010，26（1）：86-90