張丁文，劉 悅，解生旭，司云珊，劉云雪，關(guān) 欣，徐雅娟*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117;2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春 130012）

一測多評法測定青錢柳中異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和阿福豆苷的含量

張丁文1，劉 悅2，解生旭2，司云珊2，劉云雪1，關(guān) 欣1，徐雅娟2*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117;2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春 130012）

目的 建立超高效液相色譜法測定青錢柳中異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和阿福豆苷含量的一測多評法。方法 以阿福豆苷為內(nèi)參物，建立阿福豆苷與異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的相對校正因子，并用該校正因子進(jìn)行異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的含量計算（計算值），實現(xiàn)一測多評;同時采用外標(biāo)法測定藥材中3種黃酮含量（實測值），并比較計算值與實測值的差異。結(jié)果經(jīng)測定異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和阿福豆苷在藥材中的含量分別為1.403，1.314，1.633 mg/g;5批青錢柳藥材中3種異黃酮的含量計算值與實測值間無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 以外標(biāo)法測定阿福豆苷，利用相對校正因子實現(xiàn)對異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷含量進(jìn)行質(zhì)量評價準(zhǔn)確、可行。

青錢柳;含量測定;黃酮苷;超高效液相色譜

青錢柳（Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinakaja）又名青錢李（江西）［1］，系青錢柳屬（Cyclocarya Ijinsk）落葉喬木［2］。因其葉甘甜滋潤，民間常作甜茶飲［3-4］。研究［5-10］表明，黃酮類成分是青錢柳相關(guān)文獻(xiàn)報道中最多的一類成分，含量很高，也是青錢柳中重要的活性成分，該類成分在人類飲食結(jié)構(gòu)中的攝入量與心腦血管等疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系。因此，著力控制青錢柳藥材的質(zhì)量問題勢在必行。本實驗首次應(yīng)用一測多評法（Quantitative Analysis of Multi-Components By Single Marker，QAMS）［11］對青錢柳中3種黃酮成分進(jìn)行了含量測定，為青錢柳藥材的質(zhì)量控制和進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Agilent1200超高效液相色譜儀;青錢柳干燥葉購自江西省九江市修水縣，由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院徐國經(jīng)老師鑒定;阿福豆苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、異槲皮苷對照品均為實驗室自制;乙腈（色譜純）;乙酸（分析純）;水為二次蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 AgilentXDB-C18柱（1.8 μm，4.6 mm×50 mm）;流動相:A為H2O∶HOAc=98∶2，（2%乙酸pH為3.0）。流動相B為CH3CN，洗脫程序為:0～5min，20%B ～24%B;5 ～10 min，24%B ～30%B;10 ～12 min，30%B ～60%B，梯度洗脫;流速:0.4 mL/min;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:6.0 μL;檢測波長:360 nm。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱定異槲皮苷4.94 mg，槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷 4.93 mg，阿福豆苷4.92 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得，保存于4℃冰箱，備用。

2.3 供試品溶液的制備 取青錢柳干燥葉2.5 g，粉碎后置圓底燒瓶中，精密加入石油醚（60～90℃）75 mL，加熱回流提取1h，棄去提取液并揮至無醚味，加入75 mL甲醇加熱回流2次，每次1 h，合并提取液，加入75 mL乙酸乙酯萃取3次，萃取液合并后蒸干，用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，并定容至刻度，搖勻，即得，保存于4℃冰箱，備用。

2.4 線性范圍 分別精密吸取濃度為0.197 6，0.197 2，0.196 8 mg/mL的異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、阿福豆苷對照品溶液 2，4，6，8，10 μL 注入液相色譜儀，測定其峰面積，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制各成分的線性關(guān)系曲線。

2.5 精密度實驗 精密吸取2.2項下對照品溶液6 μL，重復(fù)5次進(jìn)樣，測定峰面積，計算，3種黃酮成分峰面積平均值分別為6 194.7，4 959.6，4 549.2，RSD分別為0.69%，0.78%，0.75%。

2.6 重現(xiàn)性實驗 分別取青錢柳干燥葉粉碎2.5 g，共6分，精密稱定，按2.3項下的供試品制備方法制備，測定3種黃酮成分平均含量為1.403，1.314，1.633 mg/g，RSD 分別為2.55%，2.02%，2.52%（n=6）。

2.7 穩(wěn)定性實驗 精密吸取2.3項下的供試品溶液6 μL，分別放置 0，2，4，6，8，10 h 后進(jìn)樣，測定峰面積，計算，3種黃酮成分峰面積平均值分別為 4 653.0，3 850.8，3 884.6，RSD 分 別 為 0.95%，1.08%，2.10%。

2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的青錢柳藥材干燥葉約1.25 g，精密稱定，平行6分，分別按樣品含量與對照品（1∶1）的比例加入一定量的對照品混合溶液，按2.3項下的方法進(jìn)行制備。測定，計算上述3種黃酮成分加樣回收率分別為102.54%，99.43%和100.28%，RSD分別為2.06%，4.00%，3.08%。

2.9 相對校正因子的建立

2.9.1 相對校正因子的測定 取2.2項下的對照品混合溶液，進(jìn)樣 2，4，6，8，10 μL，測定峰面積，分別計算待測組分與內(nèi)參物阿福豆苷間的相對校正因子，結(jié)果fⅡ/fⅣ平均值為1.358 8、fⅡ/fⅤ平均值為 1.091 2;RSD分別為1.29%，0.82%。

2.9.2 相對校正因子的重復(fù)性試驗 按照2.2項下的方法，配制對照品的混合溶液平均4分，分別進(jìn)樣6 μL，測定3種黃酮成分的峰面積值。分別計算待測組分與內(nèi)參物間的相對校正因子，fⅡ/fⅣ平均值為1.354 7，fⅡ/fⅤ平均值為 1.088 4;RSD分別為0.04%，0.02%。

2.9.3 相對校正因子的耐用性考察

2.9.3.1 不同色譜柱對相對校正因子的影響 試驗中采用Agilent 1200超高效液相色譜儀分別考察了Agilent XDB-C18柱（1.8 μm，4.6 mm ×50 mm）及 Agilent SB-C18柱（1.8 μm，4.6 mm ×50 mm）2 種不同型號的色譜柱對相對校正因子的影響，測得，AgilentSB-C18柱 fⅡ/fⅣ為 1.412 0，fⅡ/fⅤ為 1.137 2，AgilentXDB-C18柱 fⅡ/fⅣ為 1.352 4，fⅡ/fⅤ為 1.079 6;RSD 分別為3.45%，3.68%。

2.9.3.2 不同溫度對相對校正因子的影響 試驗中采用Agilent1200超高效液相色譜系統(tǒng)，AgilentXDBC18柱（1.8 μm，4.6 mm ×50 mm）色譜柱，在不同柱溫（25，30，35℃）條件下對相對校正因子進(jìn)行測定，測得，25 ℃fⅡ/fⅣ為 1.352 4，fⅡ/fⅤ為 1.079 6;30 ℃fⅡ/fⅣ為 1.341 3，fⅡ/fⅤ為1.072 3;35 ℃fⅡ/fⅣ為1.351 8，fⅡ/fⅤ為1.094 6;2種校正因子的RSD分別為0.46%，1.05%。

2.9.3.3 不同流速對相對校正因子的影響 試驗中采用Agilent 1200超高效液相色譜系統(tǒng)，AgilentXDBC18柱（1.8 μm，4.6 mm ×50 mm）色譜柱，在不同流速（0.3，0.4，0.5 mL/min）條件下對相對校正因子進(jìn)行測定，測得，0.3 mL/min fⅡ/fⅣ為 1.355 9，fⅡ/fⅤ為 1.090 7;0.4 mL/minfⅡ/fⅣ為 1.352 4，fⅡ/fⅤ為 1.079 6;0.5 mL/minfⅡ/fⅣ為 1.341 3，fⅡ/fⅤ為 1.072 2;2 種校正因子的RSD分別為0.56%，0.86%。

2.9.3.4 不同修飾劑對相對校正因子的影響 試驗中采用Agilent 1200超高效液相色譜系統(tǒng)，AgilentXDB-C18柱（1.8 μm，4.6 mm ×50 mm）色譜柱，考察了流動相中加入不同的修飾劑對相對校正因子的影響，測得，2% 乙酸 fⅡ/fⅣ為 1.352 4，fⅡ/fⅤ為 1.079 6;2% 甲酸 fⅡ/fⅣ為1.357 4，fⅡ/fⅤ為1.091 5;2 種校正因子的RSD分別為0.26%，0.78%。

2.9.4 相對校正因子的確定 根據(jù)實驗取測定結(jié)果的平均值，最終確定的3種成分間的相對校正因子分別為:f360nmⅡ/Ⅳ =1.355 2;f360nmⅡ/Ⅴ =1.099 8。

3 待測成分色譜峰定位參數(shù)考察

“一測多評”法應(yīng)用的前提是如何將色譜峰準(zhǔn)確定位。本實驗分別考察了采用不同進(jìn)樣量和不同型號色譜柱時待測成分與阿福豆苷色譜峰間的相對保留時間和保留時間差。結(jié)果表明，采用AgilentXDBC18柱不同進(jìn)樣量時RSD分別為1.93%、0.93%，采用AgilentSB-C18柱不同進(jìn)樣量時RSD分別為0.97%、0.48%，采用不同色譜柱時異槲皮苷和槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷與阿福豆苷相對保留時間RSD分別為0.66%、0.32%，采用不同進(jìn)樣量、不同色譜柱保留時間差的RSD也均小于5%?？梢?，與阿福豆苷色譜峰間的相對保留時間和保留時間差可作為其他2個待測成分色譜峰的定位參數(shù)。

4 數(shù)據(jù)比較

首先，應(yīng)用ESM法對5批青錢柳藥材中3種待測成分進(jìn)行多成分的同步測定，再用建立的QAMS法對待測成分進(jìn)行定位，并計算含量，最后將二者得到的結(jié)果以相對誤差進(jìn)行評價。結(jié)果表明，二者所得結(jié)果無顯著性差異，相對誤差＜5%，表明建立的青錢柳QAMS質(zhì)量評價模式具有較好的準(zhǔn)確性與可行性。結(jié)果見表2。

表2 QAMS與ESM測得的青錢柳藥材中3種黃酮類成分含量

5 結(jié)論

實驗選用甲醇作為提取溶劑，并用乙酸乙酯萃取的方法，目標(biāo)成分提取效率最高，較易操作，且干擾峰較少。流動相中加入乙酸可以改善分離效果，使峰形更尖銳、對稱，防止拖尾。

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Determination of the content of isoquercitrin，quercetin-3-O-α-L-rhamnoside and asafzelin of cyclocarya paliurus by QAMS

ZHANG Dingwen1，LIU Yue2，XIE Shengxu2，SI Yunshan2，LIU Yunxue1，GUAN Xin1，XU Yajuan2*
（1.Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130117，China;2.Jilin Academy of Chinese Medicine Sciences，Changchun 130012，China）

ObjectiveTo establish UPLC method for the determination of isoquercitrin，quercetin-3-O-α-L-rhamnoside and asafzelin in Cyclocarya paliurus by QAMS.MethodsAsafzelin was used as an internal materials，the relative correction factor between asafzelin，isoquercitrin and quercetin-3-O-α-L-rhamnoside was established，And these correction factors were used to calculate the determination of isoquercitrin，quercetin（calculated value）to achieve QAMS;at the same time，the determination of 3 kind of flavonoids in herbs（measured value）was measured by the external standard method.ResultsThrough determination，the content of isoquercitrin，quercetin-3-O-α-L-rhamnoside and asafzelin was 1.403 mg/g，1.314 mg/g，1.633 mg/g respectively;the calculated value of the content of 3 isoflavonoids in 5 batches of cyclocarya paliurus medicinal materials had no significant difference with measured value.ConclusionIt was correct and feasible to determinate asafzelin by ESM，and conduct quality evaluation of the content of isoquercitrin and quercetin-3-O-α-L-rhamnoside by using the relative correction factors.

cyclocarya paliurus;determination;flavonoid glycosides;ultra performance liquid chromatography

R284.2

A

2095－6258（2014）05－0810－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.05.018

科技部重大創(chuàng)制藥物專項（2009ZX09103-447）。

張丁文（1988－），女，碩士研究生。研究方向:藥物活性物質(zhì)分析與結(jié)構(gòu)研究。

徐雅娟，電話:0431-86058690，電子信箱:1045758849@qq.com。

2014－05－19）