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(1.北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院,北京 101300；2. 北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評估中心,北京 100041)

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定腐竹中烏洛托品的含量

吳穎1,張慧1,崔芳1,姜潔2

(1.北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院,北京 101300；2. 北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評估中心,北京 100041)

建立用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)測定腐竹中烏洛托品含量的方法。用乙腈提取腐竹中的烏洛托品,經(jīng)固相萃取柱PXA凈化,用UPLC-MS/MS分析,采用多反應(yīng)監(jiān)測模式,外標(biāo)法定量。采用ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱,以乙酸銨和乙腈為流動(dòng)相,進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明:該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線良好,線性范圍為1～20μg/L,最低檢出限為1μg/L,三個(gè)水平添加濃度的平均回收率范圍為81.67%～101.67%。本方法操作簡單快捷,方法準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性好。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,腐竹,烏洛托品,檢測

腐竹是一種人們喜愛的傳統(tǒng)豆制品,但是其保存周期很短,為了使腐竹外表光鮮、保質(zhì)期長,一些不法廠家在生產(chǎn)的過程中常非法添加硼砂和吊白塊,經(jīng)過多年的專項(xiàng)治理整頓,已經(jīng)鮮少見到,但是他們的添加手法和技術(shù)也日趨先進(jìn)和隱蔽,目前監(jiān)管部門已經(jīng)發(fā)現(xiàn)烏洛托品已經(jīng)作為吊白塊的替代品添加到腐竹中。

烏洛托品(urotropine),又名六亞甲基四胺(hexamethylenetetramine),本身是屬于低毒類,常應(yīng)用于醫(yī)藥和工業(yè)上。作為非法添加物,它主要起到防腐,增白,改善產(chǎn)品外觀的作用,其原理在于烏洛托品在酸性條件下可以分解產(chǎn)生甲醛,對人體的腎、肝、中樞神經(jīng)、免疫功能、消化系統(tǒng)等均有損害,嚴(yán)禁用于食品或食品加工過程中。目前,我國還沒有檢測腐竹中烏洛托品的標(biāo)準(zhǔn),僅有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2226-2008應(yīng)用于雞肉、雞肝臟、雞腎臟和豬肉中烏洛托品的檢測[1]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用于腐竹中的檢測目前已有少數(shù)報(bào)道,有激光拉曼光譜法[2]、氣相色譜法[3-4]、液相色譜法[5]、和液質(zhì)聯(lián)用法等方法[6-7],因此開展相關(guān)檢測工作很有意義。本文建立了腐竹的超高效液相色譜及串聯(lián)質(zhì)譜方法,此方法的開發(fā),可大大減少樣品分析時(shí)間。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)品 購于sigma公司,純度≥99%。100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲備液由乙腈溶解,并置于4℃冰箱中密封保存。色譜純甲醇、乙腈和乙酸銨 購于Dikma公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。固相萃取柱 購于DIKMA公司的ProElut PXA,規(guī)格為150mg/6mL。

Waters ACQULITY UPLC超高效液相色譜儀；Waters Quattro Premier XE質(zhì)譜儀(Waters,USA)；高速冷凍離心機(jī)(SIGMA,德國)；均質(zhì)機(jī)；氮吹儀;ACQULITY UPLC BEH HILIC色譜柱2.1×50mm,1.7μm。

1.2色譜分析條件

液相色譜操作條件:流速:0.3mL/min；柱溫:40℃；進(jìn)樣體積:10μL；流動(dòng)相:A為10mmol/L 乙酸銨溶液,B為乙腈；梯度洗脫條件如表1。

表1 液相梯度條件Table 1 Condition of gradient elution

質(zhì)譜離子源選用電噴霧離子源(ESI)；掃描模式:正離子掃描(ESI+)；檢測方式:多反應(yīng)檢測；干燥氣:氮?dú)猓浑x子源溫度:110℃,脫溶劑溫度:350℃,脫溶劑氣:600L/h,錐孔氣:50L/h。質(zhì)譜分析條件見表2。

表2 質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 Parameter of mass spectra

注:*標(biāo)注的子離子為定量離子。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和曲線繪制

精密稱取烏洛托品1mg溶解于10mL乙腈,配制成濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液,將濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液稀釋100倍,配成濃度為1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液,再配制成工作液,濃度梯度為1,2,5,10,20μg/L,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4樣品前處理

1.4.1 提取 稱取1.0g腐竹(精確至0.01g)(已粉碎均勻)和1.0g無水硫酸鈉于聚四氟乙烯離心管中,加入10mL乙腈溶液,渦旋混合2min,超聲10min,10000r/min離心10min,取上清液待凈化。

1.4.2 凈化 將PXA小柱用5mL乙腈活化,將1.4.1中上清液加入柱中,收集流出液(1),再加入1mL乙腈,收集流出液(2),合并流出液,用N2吹干,用90∶10的乙腈∶水溶解定容至1mL,渦旋混勻。過 0.22μm 濾膜,待上機(jī)使用。

2 結(jié)果與分析

2.1樣品前處理?xiàng)l件的選擇

腐竹樣品采用乙腈提取,是由于烏洛托品在乙腈中溶解度高,可以保證較好的提取效果。凈化過程選用了保留干擾物模式,PXA屬于強(qiáng)陰離子交換小柱,可以很好的吸附脂肪酸類和氨基酸類的雜質(zhì),上樣后,烏洛托品在小柱上面沒有保留,隨之流出。本實(shí)驗(yàn)通過氮吹的方式,進(jìn)行富集濃縮,再用乙腈∶水=90∶10定容,較好的排除了基質(zhì)的干擾,操作簡便快速,提高了檢測靈敏度和準(zhǔn)確性,具備較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

2.2液相色譜-質(zhì)譜條件的選擇

BEH HILIC柱是一種可以保留一些強(qiáng)極性物質(zhì)的色譜柱,這些物質(zhì)在普通的C18的保留性差或者無保留,有分離效果不好、峰型拖尾等問題,因此本文沒有采用C18柱,選用BEH HILIC色譜柱。本實(shí)驗(yàn)嘗試了含有甲酸的水溶液-乙腈、水-乙腈和含有乙酸銨的水溶液-乙腈進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)含有乙酸銨的水溶液-乙腈的流動(dòng)相分離的效果好,峰型對稱。這也是BEH HILIC色譜柱的特性,可以結(jié)合高比例有機(jī)相/低比例水相組成的流動(dòng)相來保留目標(biāo)物質(zhì),同時(shí)這樣的流動(dòng)相組成也有利于提高電噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS)的靈敏度。在ESI+電離方式下,進(jìn)行了儀器的毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)的優(yōu)化選擇。如圖1和圖2分別為烏洛托品的總離子流圖和多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖,其中圖2分別為是標(biāo)樣母離子打碎后的選定的兩個(gè)碎片離子的圖,定量離子圖和定性離子圖。在樣品中,目標(biāo)峰可以有很好的響應(yīng),和雜峰分離良好。

圖1 總離子流圖Fig.1 Total ionic chromatographic

圖2 多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.2 Multiple reaction monitoring chromatogram

2.3方法線性范圍、測定低限及精密度

將工作液分別進(jìn)樣10μL,得到回歸方程(Y為峰面積,X為濃度,μg/L)Y=174.564×X+0.775512,線性相關(guān)系數(shù)R為0.998,在1～20μg/L濃度范圍內(nèi)成良好的線性。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Calibration curve

在腐竹空白樣品中添加低、中、高三個(gè)含量的烏洛托品,按照方法操作步驟進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn),同時(shí)每個(gè)添加濃度平行重復(fù)6次,測定精密度,以S/N≥10計(jì)的測定低限和標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表3所示。由表3可以看出,加標(biāo)回收率在81.67%～101.67%,其多次測定的RSD在1.84%～3.99%,方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足分析要求。腐竹空白樣品上添加濃度為2μg/L的色譜圖見圖4。

表3 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations(n=6)

圖4 添加烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)品(2μg/L)的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of a sample spiked with urotropine at 2μg/L

3 結(jié)論

本研究建立了固相萃取凈化、液質(zhì)聯(lián)用檢測腐竹中烏洛托品含量的方法,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法操作簡單快捷,準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性好。應(yīng)用該法檢測了市場和商超6個(gè)不同品牌的腐竹產(chǎn)品,均未發(fā)現(xiàn)有烏洛托品的殘留。另外本實(shí)驗(yàn)僅探討了腐竹中的烏洛托品的含量,其余的豆制品的分析尚需進(jìn)一步探討。

[1]SN/T 2226-2008 進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中烏洛托品殘留量的檢測方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S].

[2]張濤,李戰(zhàn)海,李炎,等.非法食品添加劑烏洛托品的拉曼光譜及DFT分析方法[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊,2013,(2):36-37.

[3]李薇,陳天科,徐輝,等.烏洛托品的氣相色譜分析[J].分析儀器,2007,(3):29-31.

[4]黃國春.氣相色譜法測定腐竹中烏洛托品含量的研究[J].廣西輕工業(yè),2008,(6):26-27.

[5]李莉,張鋼平.高效液相色譜法測定烏洛托品片的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2009,(4):335-336.

[6]洗燕萍,陳立偉,羅東輝,等.UPLC-MS/MS測定腐竹和米粉中的烏洛托品[J].江南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012,(11):78-82.

[7]陸春良,劉娟,劉向農(nóng).親水作用液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定米線中烏洛托品殘留[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2013,(2):82-86.

Determination of Urotropine in dried beancurd sticks by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

WUYing1,ZHANGHui1,CUIFang1,JIANGJie2

(1. Beijing Products Quality Supervision and Inspection Institute;Beijing 101300,China;2. Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment;Beijing 100041,China;)

A method for the determination of urotropine in dried beancurd sticks was established by UPLC-MS/MS.The sample was extracted with acetonitrile as extraction solvents,then further purified by PXA solid phase extraction column. The analyte was determined by multi-reaction monitoring(MRM)mode was employed for the quantitative determination,and quantified by the external standard curve.The separation was performed on a UPLC ACQUITY BEH HILIC column by gradient elution with a system of water(containing 10mmol/L ammonium acetate buffer)-acetonitrile as mobile phase.Results showed that the calibration curve had good linearity.The developed method exhibited good linearity over the range from 1 to 20μg/L.The minimum detection limit was 1μg/L. The average recovery rate for urotropine was 81.67%～101.67%.The method is simple,accurate and suitable for the identification and quantification.

Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;dried beancurd sticks;urotropine;determination

2014-01-24 *通訊聯(lián)系人

吳穎(1965-),女,高級工程師,研究方向:生物化工。

TS

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001