王海峰，楊 宏，胡禮炳，雷永虹，秦 揚(yáng)，李 俊，畢城偉，霍 倩

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，昆明 650101；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院泌尿外科，昆明 650101）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在國內(nèi)其發(fā)病率和病死率均占泌尿系腫瘤的首位，且近年有增加趨勢，男性發(fā)病率約為女性的4倍，易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高［1］。近年來隨著人們對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制研究和分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展的深入，基因靶向治療在臨床中受到越來越多的關(guān)注，因此尋找治療膀胱癌的分子靶點(diǎn)具有十分重要的意義。果蠅的Enhancer of Zeste基因增強(qiáng)子人類同源物2（ebgabcer of zest homolog，EZH2）是多梳基因家族（polycomb group，PcG）的主要成員，是組蛋白H3第27位賴氨酸特異性的甲基化轉(zhuǎn)移酶，通過沉默與細(xì)胞分化、抑制增殖相關(guān)基因而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［2］。多項(xiàng)研究顯示其過量表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌［3］、結(jié)腸癌［4］、急性淋巴細(xì)胞白血?。?］、前列腺癌［6］、卵巢癌［7］等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)。本研究以EZH2基因?yàn)榘悬c(diǎn)，設(shè)計(jì)構(gòu)建其小干擾RNA（siRNA）的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染膀胱癌T24細(xì)胞，觀察EZH2基因?qū)Π螂装┘?xì)胞增殖、侵襲、遷移能力及凋亡的影響，旨在為膀胱癌的基因治療尋找新的靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 膀胱癌T24細(xì)胞株由昆明醫(yī)科大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶乙二胺四乙酸（EDTA）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑購自美國Invitrogen公司，二甲亞砜（DMSO）購自美國Amersco公司，EZH2抗體購自美國Abcam公司，EZH2siRNA套裝購于廣州銳博生物公司，聚氟乙烯（PVDF）膜購于美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 膀胱癌癌細(xì)胞株T24分別在含10%胎牛血清的90%RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 根據(jù)GeneBank提供的EZH2基因序列，使用在線設(shè)計(jì)軟件，通過基因序列比對(duì)，合成EZH2特異性siRNAs序列5′－GGG AAA GUG UAU GAU AAU TT－3′，陰 性 對(duì) 照 siRNAs 序 列 為 5′－UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT－3′。將其合成序列插入到 PGenesil－1.1質(zhì)粒構(gòu)建重組體，并轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。分別挑取菌落接種于含4mg／mL新霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，再使用堿裂解法抽提質(zhì)粒，并行酶切鑒定和測序分析。轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書的要求進(jìn)行，每孔siRNA為4μg，LipofectamineTM2000的用量為10 μL，轉(zhuǎn)染后置入CO2培養(yǎng)箱，6h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48～72h后收集細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（不經(jīng)任何處理）、陰性對(duì)照組和干擾組（分干擾1組、干擾2組、干擾3組）。

1.2.3 轉(zhuǎn)染后RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以NCBI數(shù)據(jù)庫中NM＿004456和NM＿152998為參考，設(shè)計(jì)EZH2的siRNA各3條（廣州銳博生物合成）。收集轉(zhuǎn)染48h后的T24細(xì)胞，按天根DP431試劑使用說明書提取細(xì)胞的總RNA，經(jīng)檢測濃度和完整性后，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明操作。先逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，再以各組cDNA為模板對(duì)EZH2基因和內(nèi)參βactin進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。每一個(gè)樣品均做3個(gè)重復(fù)反應(yīng)。同時(shí)設(shè)無模板對(duì)照。在熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測。反應(yīng)條件：95℃15s；95℃5s、60℃60s，30個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增完畢后進(jìn)行熔解曲線分析：95℃15s，60℃30s，72℃30s。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析特異性。實(shí)時(shí)定量分析采用2－ΔΔCt方法。β－actin上游引物5′－GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA－3′，下游引物 5′－GAG GGT CTC TCT CTT CCT－3′；EZH2 上 游 引 物 5′－GCG CGG GAC GAA GAAT AAT CAT－3′；下游引物5′－TAC ACG CTT CCG CCA ACA AAC T－3′。

1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況 將傳4～6代的T24細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)，按2×103／孔的濃度接種96孔板，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h。更新鮮培養(yǎng)基后培養(yǎng)2h，轉(zhuǎn)染EZH2－siRNA進(jìn)細(xì)胞。24h后開始檢測，設(shè)置調(diào)零孔、對(duì)照孔，每組3復(fù)孔。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。離心棄去上清，加入含500μg／mL MTT 的DMEM／F12培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心棄上清，加150μL DMSO待充分溶解后，用酶標(biāo)儀檢測各孔490nm吸光度。每組細(xì)胞測3個(gè)孔，取平均值，每隔12h檢測1次，連續(xù)檢測72 h，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 用筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻地劃橫線，大約每隔0.5～1.0cm 1道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)平行樣本。T24細(xì)胞以3×106／孔接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，用EZH2－siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，再進(jìn)行培養(yǎng)，24h后更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁率為100%時(shí)，用比著直尺，垂直畫線。用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。在光學(xué)顯微鏡下觀察劃痕修復(fù)過程，取12、24h為時(shí)間點(diǎn)拍照記錄。

1.2.6 Transwell細(xì)胞小室檢測細(xì)胞侵襲能力 收集陰性對(duì)照組和干擾2組細(xì)胞，用0.25%胰酶消化并制成單細(xì)胞懸液。用無血清MEM培養(yǎng)基將 Matrigel配制成10μg／250μL（1∶300）的人工基底膜膠備用。24孔板每孔中鋪 Matrigel 3μg／80μL，放于超凈臺(tái)中風(fēng)干過夜。24孔板每孔加入適量無血清MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，放置60～90min，洗去多余的膠；取兩組細(xì)胞以2×105／孔重懸加入上室內(nèi)，設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞小室，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，洗去未黏附細(xì)胞。常規(guī)固定染色后光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)膜背面侵襲的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)數(shù)中間和四周共5個(gè)視野，每組細(xì)胞計(jì)數(shù)3份，取平均值。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 用不含EDTA的胰酶消化收集培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染24h后的T24細(xì)胞，離心、洗滌后加入500μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，接著先加入5μL熒光標(biāo)記的膜連蛋白V（Annexin V－FITC）混勻后，加入5μL碘化化丙啶（PI），混勻，室溫避光反應(yīng)5～15min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以表示，采用方差分析，組間比較采用S－N－K法（q檢驗(yàn)），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＞0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EZH2－siRNA對(duì)EZH2mRNA表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)T24細(xì)胞內(nèi)EZH2mRNA表達(dá)，藥物篩選后建立的細(xì)胞系經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測EZH2的mRNA相對(duì)表達(dá)量，RT－PCR結(jié)果示：空白對(duì)照組1.187±0.052、陰性對(duì)照組1.192±0.025、干擾1組0.185±0.012、干擾2組0.027±0.009、干擾3組0.157±0.017；3個(gè)干擾組細(xì)胞EZH2mRNA相對(duì)表達(dá)均低于空白、陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其中，半定量PCR顯示干擾2組效果最好，表達(dá)最低，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，由于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以后續(xù)試驗(yàn)均采用干擾2組與陰性對(duì)照組之間比較。見圖1。

圖1 半定量PCR檢測EZH2－siRNA對(duì)EZH2mRNA達(dá)的影響

圖2 MTT檢測EZH2－siRNA對(duì)T24細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 EZH2表達(dá)沉默對(duì)T24細(xì)胞增殖活性的影響 MTT檢測法結(jié)果示：干擾2組細(xì)胞從轉(zhuǎn)染后24h起，細(xì)胞增殖速度開始變得緩慢，其明顯慢于陰性對(duì)照組，其抑制率分別為36.2%、37.1%、37.9%和30.8%，38.2%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測EZH2－siRNA對(duì)T24細(xì)胞遷移能力的影響（×200）

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：劃痕處理24h后，陰性對(duì)照組和轉(zhuǎn)染2組細(xì)胞的遷移距離分別為（1.98±0.07）μm和（1.37±0.12）μm。與陰性對(duì)照組比較，干擾2組細(xì)胞水平運(yùn)動(dòng)距離明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

2.4 EZH2表達(dá)沉默對(duì)T24細(xì)胞凋亡的影響 Annexin－v／PI雙染，轉(zhuǎn)染48h后陰性對(duì)照組早、晚期T24細(xì)胞凋亡率分別為7.31%和2.49%，而干擾2組為22.8%和3.60%，與陰性對(duì)照組比較，干擾2組早期凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示EHZ2基因的沉默增加了T24細(xì)胞早期凋亡，見圖4。

2.5 EZH2表達(dá)沉默對(duì)T24細(xì)胞基質(zhì)侵襲能力的影響 Transwell細(xì)胞小室檢測細(xì)胞侵襲能力結(jié)果顯示：光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)膜背面干擾2組較陰性對(duì)照組侵入細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖5。

圖4 采用Transwell細(xì)胞小室法檢測EZH2－siRNA對(duì)T24細(xì)胞侵襲能力的影響（×200）

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測EZH2－siRNA沉默對(duì)T24細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

多梳蛋白抑制性復(fù)合物2（polycomb repressor complex 2，PRC2）是組蛋白H3第27位賴氨酸特異性的甲基化轉(zhuǎn)移酶，通過沉默與細(xì)胞分化、抑制增殖在內(nèi)的基因而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，而EZH2是PRC2中起催化作用的核心蛋白，它參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成、基因表達(dá)調(diào)節(jié)及生長控制，因而具有多潛能性［8－9］。EZH2在PcG和TrxG蛋白復(fù)合物的形成、造血細(xì)胞發(fā)育分化、X染色體滅活、甚至惡性腫瘤形成等過程均具有重要作用。

目前，關(guān)于EZH2作為癌基因與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移侵襲能力及預(yù)后的相關(guān)性已逐漸成為研究的熱點(diǎn)［10］。Wan等［11］定量分析EZH2表達(dá)與肺癌的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)隨著肺癌的發(fā)展，EZH2的陽性單位值（PU）逐漸升高，提示在肺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中，EZH2可能發(fā)揮了重要的作用。Hang等［12］發(fā)現(xiàn)，EZH2在膀胱上皮癌中普遍高表達(dá)，并與其惡性程度呈正相關(guān)，表明EZH2基因在膀胱上皮癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用，據(jù)此推測EZH2可作為膀胱癌的一個(gè)有效的生物標(biāo)志物，并可能成為其潛在的治療靶點(diǎn)。

近年來，siRNA沉默基因表達(dá)在功能基因組學(xué)研究領(lǐng)域中受到越來越多的重視，已被廣泛應(yīng)用于腫瘤相關(guān)基因的功能研究。研究發(fā)現(xiàn)在膀胱移行細(xì)胞癌中，microRNA－101能直接抑制EZH2的表達(dá)而改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而減弱腫瘤細(xì)胞的增殖能力［13］。Bo等［14］研究認(rèn)為，microRNA－203能抑制Bcl－w的表達(dá)而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的凋亡，從而減弱細(xì)胞的增殖。Guo等［15］發(fā)現(xiàn)在膀胱癌細(xì)胞中 microRNA－144的表達(dá)降低，microRNA－144通過EZH2／Nkd1通路調(diào)節(jié) Wnt信號(hào)從而抑制EZH2的表達(dá)。

本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默EZH2基因，探討其對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞活性和凋亡的影響。為了明確EZH2表達(dá)在T24細(xì)胞生物活性過程中的作用，本研究利用基因工程的手段在體外構(gòu)建人EZH2基因的siRNA的質(zhì)粒表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染入T24細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測其對(duì)T24細(xì)胞EZH2基因表達(dá)的沉默效果。檢測結(jié)果顯示，3個(gè)干擾組細(xì)胞EZH2的mRNA表達(dá)均低于其他對(duì)照組，EZH2表達(dá)水平基本被沉默，可構(gòu)建EZH2基因功能分析的體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型。

腫瘤細(xì)胞的持續(xù)分裂與無限增殖能力是腫瘤惡性程度的重要標(biāo)志。本研究通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分析阻斷EZH2表達(dá)后T24細(xì)胞增殖能力的變化，MTT檢測結(jié)果顯示從轉(zhuǎn)染后24h起，其抑制率分別為36.2%、37.1%、37.9%、30.8%、38.2%。干擾2組細(xì)胞增殖速度明顯慢于陰性對(duì)照組，提示EZH2沉默能抑制T24細(xì)胞的增殖活性。

腫瘤細(xì)胞侵襲力是影響患者預(yù)后及生存率的關(guān)鍵因素。本研究通過Transwell細(xì)胞小室檢測T24細(xì)胞侵襲能力的改變。光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)膜背面細(xì)胞侵入T24細(xì)胞的數(shù)量，干擾2組較對(duì)照組侵入細(xì)胞數(shù)量明顯減少。提示轉(zhuǎn)染入EZH2－siRNA的T24細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱。

遷移在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中也必不可少。腫瘤細(xì)胞與母體瘤分離，穿過血管壁、侵襲正常組織，需要一定的運(yùn)動(dòng)能力。本法借鑒體外細(xì)胞致傷愈合實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜏y定腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上的運(yùn)動(dòng)特性，結(jié)果顯示：劃痕處理24h后，陰性對(duì)照組和干擾2組細(xì)胞的遷移距離分別為（1.98±0.07）μm和（1.37±0.12）μm。與陰性對(duì)照組相比，干擾2組細(xì)胞水平運(yùn)動(dòng)距離明顯降低。提示轉(zhuǎn)染入EZH2－siRNA的T24細(xì)胞的遷移能力明顯減弱。

為了檢測EZH2基因沉默對(duì)T24細(xì)胞凋亡的影響，本研究進(jìn)行了Annexin－v／PI雙染，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染48h后干擾2組早、晚期T24細(xì)胞凋亡率分別為為22.8%和3.60%，較陰性對(duì)照組均增加，以早期尤為明顯，表明EHZ2基因沉默能夠增加T24細(xì)胞凋亡，提示EZH2可能對(duì)于膀胱癌T24細(xì)胞存在直接的治療作用新靶點(diǎn)。

綜上所述，EZH2與T24膀胱癌細(xì)胞的活性及凋亡密切相關(guān)，靶向抑制T24膀胱癌細(xì)胞內(nèi)EZH2表達(dá)可抑制T24膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，并促進(jìn)其凋亡。本研究為深入了解EZH2在T24膀胱癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的分子調(diào)控機(jī)制研究及為EZH2成為T24膀胱癌細(xì)胞的潛在分子標(biāo)志物和靶向治療的新靶點(diǎn)鑒定了基礎(chǔ)。

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