王金泗，陳曉耕，林孟波

（福建省立醫(yī)院腫瘤外科，福州 350001）

腫瘤生物學(xué)研究顯示惡性腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多步驟的過(guò)程并涉及許多基因修飾，細(xì)胞與細(xì)胞之間黏附缺失與腫瘤進(jìn)展和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，該過(guò)程涉及包括小窩蛋白（caveolin－1）、E鈣黏蛋白（E－cadherin）和β連環(huán)蛋白（β－catenin）在內(nèi)的許多細(xì)胞膜分子和基因［1－4］。E－cadherin主要參與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞與細(xì)胞之間黏附，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，在胃癌和卵巢癌等許多惡性腫瘤中，E－cadherin表達(dá)下調(diào)或缺失是侵襲性腫瘤的重要特征，并與患者不良預(yù)后相關(guān)［5］。Bcl－6共抑制因子樣蛋白1（BCL6corepressor－like 1，BCORL1）是近期研究證實(shí)的一種轉(zhuǎn)錄共抑制因子，其與組蛋白脫乙?；福℉DAC）活性相關(guān)，BCORL1通過(guò)與C－末端結(jié)合蛋白（CtBP）協(xié)同或單獨(dú)與E－cadherin啟動(dòng)子結(jié)合，從而抑制E－cadherin基因轉(zhuǎn)錄［6］。本課題擬通過(guò)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)BCORL1和E－cadhein在胃癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，分析其與胃癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性及兩者表達(dá)的相關(guān)性，初步探討B(tài)CORL1及E－cadherin在胃癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，為胃癌治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 58例胃癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織來(lái)源于2007年1月至2009年10月本院病理科保存的手術(shù)切除標(biāo)本，其中男49例，女9例，年齡29～78歲，平均（59.6±10.4）歲。中分化管狀腺癌和黏液癌歸為分化型腫瘤，實(shí)體低分化腺癌、非實(shí)體低分化腺癌及印戒細(xì)胞癌歸為未分化癌，組織病理學(xué)診斷：分化型腺癌14例，低分化腺癌42例，未分化癌2例。TNM分期參考國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）分類（6版）：Ⅰ期9例，Ⅱ期7例，Ⅲ期17例，Ⅳ期25例。浸潤(rùn)深度分為黏膜、黏膜下、肌層和漿膜下層。所有患者術(shù)前均未行放射、化療及免疫治療，本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)組織中BCORL1及E－cadherin表達(dá) 采用標(biāo)準(zhǔn)生物素－鏈霉菌抗生物素蛋白－過(guò)氧化物酶（SP）法對(duì)4μm石蠟切片進(jìn)行染色。切片二甲苯脫蠟及梯度乙醇再水化之后，在10mmol／L檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中煮沸20min進(jìn)行抗原修復(fù)，3%雙氧水封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，3%牛血清清蛋白封閉1h之后，將1∶100稀釋的兔抗人BCORL1多克隆抗體（HPA031775，美國(guó)Sigma）和兔抗人E－cadherin單克隆抗體（＃3195，美國(guó)Cell Signaling）加于標(biāo)本后，置于濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，37℃溫箱孵育20min。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，孵育30min。滴加DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，鹽酸乙醇脫色，稀氨水反藍(lán)，梯度乙醇脫水至透明。顯微鏡下觀察、成像系統(tǒng)拍照，統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色評(píng)估 所有切片由兩位病理科醫(yī)生獨(dú)立進(jìn)行半定量評(píng)分，用染色強(qiáng)度聯(lián)合陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分，染色強(qiáng)度分為4等級(jí)：陰性0分；弱陽(yáng)性1分；中度2分；強(qiáng)陽(yáng)性3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比分級(jí)如下：陽(yáng)性細(xì)胞小于或等于5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分相乘大于或等于1分則認(rèn)為BCORL1或E－cadherin陽(yáng)性表達(dá)［7］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用s表示，采用χ2檢驗(yàn)分析，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中BCORL1和E－cadherin的表達(dá)

對(duì)收集的58例胃癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織進(jìn)行BCORL1和E－cadherin免疫組織化學(xué)染色，陽(yáng)性染色為棕黃色或棕褐色，BCROL1表達(dá)主要定位在胞質(zhì)和胞膜，E－cadherin表達(dá)主要定位于胞膜，見(jiàn)圖1。BCORL1和E－cadherin在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為60.3%（35／58）和27.6%（16／58），而在對(duì)應(yīng)癌旁組織BCORL1和E－cadherin的陽(yáng)性表達(dá)率分別為17.2%（10／58）和63.8%（37／58），兩 組 差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義 （χ2＝22.692，P＝0.000；χ2＝15.321，P＝0.000）。

圖1 BCORL1和E－cadherin在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)（SP×400）

2.2 BCORL1和E－cadherin表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

BCORL1及E－cadherin表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表1。BCORL1和E－cadherin表達(dá)與腫瘤組織病理分化、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)（P＜0.05），與性別、年齡和腫瘤大小無(wú)關(guān)。

表1 BCORL1和E－cadherin表達(dá)水平與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系（n）

2.3 胃癌組織中BCORL1與E－cadherin表達(dá)的相關(guān)性 應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色評(píng)分半定量BCORL1和E－cadherin表達(dá)，Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示在胃癌組織中的BCORL1與 E－cadherin表 達(dá) 呈 負(fù) 相 關(guān) （r＝ －0.571，P＝0.002）。

3 討 論

BCORL1基因定位于X染色體，是一個(gè)轉(zhuǎn)錄共抑制因子，功能研究發(fā)現(xiàn)其可以與Ⅱ類組蛋白脫乙?；福℉DAC4、HDAC5和HDAC7）結(jié)合，與CTBP1共抑制因子相互作用抑制E－cadherin表達(dá)［8－10］。在多數(shù)正常組織中 BCORL1低表達(dá)，而在睪丸和前列腺組織中高表達(dá)，有研究通過(guò)測(cè)序分析肝細(xì)胞癌的特征，發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌中BCORL1與EFL1形成融合基因，其mRNA表達(dá)水平比正常癌旁組織高出6倍多，提示BCORL1是一個(gè)腫瘤相關(guān)基因［11］。但是在6%的急性髓性白血?。ˋML）患者以及21%的AML細(xì)胞系中的存在BCORL1基因突變，提示BCORL1是一個(gè)新的候選腫瘤促進(jìn)基因［9］。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中BCORL1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織，其在未分化、浸潤(rùn)較深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高TNM分期腫瘤中陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高，提示BCORL1可能作為癌基因發(fā)揮相應(yīng)功能。E－cadherin低表達(dá)或缺失與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)E－cadherin可減弱細(xì)胞與細(xì)胞黏附能力，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞更容易浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)E－cadherin在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于對(duì)應(yīng)癌旁組織，其在未分化、浸潤(rùn)較深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高TNM分期腫瘤中陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低，提示E－cadherin表達(dá)減少促進(jìn)胃癌進(jìn)展。

從基因表達(dá)到運(yùn)輸以及細(xì)胞表面蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換，E－cadherin的表達(dá)在多個(gè)水平被調(diào)控，許多轉(zhuǎn)錄抑制因子被報(bào)道能與E－cadherin啟動(dòng)子區(qū)域的E－box序列結(jié)合誘導(dǎo)其表達(dá)下調(diào)，如鋅指蛋白Snail／Slug超家族以及 ZEB1和 ZEB2［12－13］。另外一個(gè)導(dǎo)致E－cadherin沉默的相關(guān)機(jī)制是啟動(dòng)子超甲基化［14］。在胃癌形成中E－cadherin是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的腫瘤抑制基因，與散在和遺傳類型胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，而E－cadherin遺傳種系突變是導(dǎo)致遺傳性彌漫型胃癌的重要原因［15］。本研究分析了BCORL1及E－cadherin在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)BCORL1與E－cadherin蛋白表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)，提示BCORL1在胃癌中可能也通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制E－cadherin表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。目前BCORL1在惡性腫瘤中的研究相對(duì)較少，本研究通過(guò)檢測(cè)其在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)以及其與經(jīng)典抑癌基因E－cadherin的相關(guān)性，初步推測(cè)其在胃癌中可能是一個(gè)癌基因，通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制E－cadherin發(fā)揮促癌功能，但具體的功能及精確的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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