程大友，崔 杰，牛 佳，代翠紅，白 晨

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，150090哈爾濱;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，010031呼和浩特)

目前利用作物的雄性不育特性生產(chǎn)雜交種已成為異交作物種子生產(chǎn)的主流.研究作物雄性不育分子機(jī)理已成為分子育種的研究熱點(diǎn)［1］.隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)組分析已應(yīng)用于擬南芥、水稻和西紅柿［2-4］等植物的研究中.在成熟的花粉中大量的蛋白已被鑒定出來(lái).通過(guò)對(duì)水稻花藥小孢子時(shí)期的蛋白質(zhì)組分析，揭示了富含甘氨酸蛋白、熱激蛋白、翻譯控制蛋白和一些管家蛋白以及在小孢子發(fā)育過(guò)程中的潛在因子［5］.在擬南芥雄性不育突變體中，孢子發(fā)育時(shí)腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(APRT)活性的喪失被認(rèn)為是導(dǎo)致不育的原因［6］;水稻的花藥中，低溫脅迫也能引起雄性不育，這與熱激蛋白和β-拓展蛋白的部分阻斷有關(guān)［7］，在大豆的雄性不育系 NJCMS1A及其保持系中鑒定出了一些在乙烯合成、細(xì)胞程序性死亡、ATP合成、淀粉合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用的蛋白，推測(cè)細(xì)胞質(zhì)雄性不育可能是因?yàn)檫@些過(guò)程中某蛋白缺失或功能改變，造成這些程序紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致雄性不育［8］;在紅蓮型水稻的CMS花藥中發(fā)現(xiàn)缺少與乙酰輔酶A合成有關(guān)的酶(乙酰輔酶A合成酶和二氫硫辛酸脫氫酶)，導(dǎo)致三羧酸循環(huán)(TCA)和脂肪酸代謝不能正常進(jìn)行，影響呼吸和能量代謝，最終導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)雄性不育［9］.此外，研究發(fā)現(xiàn)水稻、小麥、番茄等雄性不育還與光合作用過(guò)程中的一些酶有關(guān)，如葉綠體氧增強(qiáng)蛋白1(chloroplast oxygen-evolving enhancer protein 1)和 1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)［10-12］.因此，推測(cè)雄性不育可能與光合酶系的功能缺陷有關(guān).甜菜在育性相關(guān)蛋白方面的報(bào)道較少，Masayuki P等在甜菜雄性不育I-12CMS(3)細(xì)胞質(zhì)中找到一個(gè)12 KD的蛋白，該蛋白是只在不育系中出現(xiàn)的orf129的蛋白產(chǎn)物;Atp6的5＇前導(dǎo)序列preSatp6只在CMS型線(xiàn)粒體中表達(dá)一種35 KD的蛋白［13-14］，推測(cè)這兩個(gè)蛋白可能與雄性不育有關(guān)，但是并沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步的研究.

本文利用2-DE與MALDI-TOF-MS方法對(duì)甜菜質(zhì)核互作型雄性不育系及保持系花蕾發(fā)育的3個(gè)階段蛋白差異表達(dá)進(jìn)行研究，以期揭示Owen型甜菜不育系與保持系花蕾不同發(fā)育時(shí)期蛋白表達(dá)的差異.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

所用材料來(lái)自哈爾濱工業(yè)大學(xué)自育的甜菜不育系DY5-CMS及其保持系DY5-O.經(jīng)過(guò)春化處理的甜菜母根，于4月20日種植在哈爾濱工業(yè)大學(xué)甜菜育種試驗(yàn)田，6月25日～7月15日期間進(jìn)行甜菜花期取樣調(diào)查.甜菜花蕾發(fā)育分成3個(gè)時(shí)期:雄蕊原基分化期、四分體時(shí)期及單核時(shí)期.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甜菜花蕾蛋白的提取

采用TCA-丙酮沉淀法提取蛋白［15］，將濃縮后的蛋白干粉置于-20℃保存?zhèn)溆?取13 mg濃縮后的蛋白干粉，加入150 μL蛋白裂解液反復(fù)凍融使其復(fù)融，采用Brandford法測(cè)定蛋白含量，標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清白蛋白(BSA).

1.2.2 雙向凝膠電泳

第一向等電聚焦電泳參照Bio-Rad公司等電聚焦系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;第二向電泳參照文獻(xiàn)［15］方法進(jìn)行.

1.2.3 MALDI-TOF-TOF/MS質(zhì)譜分析

經(jīng)脫色清洗后，將凝膠掃描采集圖像利用Image Master 2D Platinum 5.0軟件(GE公司)分析蛋白質(zhì)圖譜.經(jīng)點(diǎn)探測(cè)、匹配，找出差異點(diǎn).將3次重復(fù)均出現(xiàn)且特征明顯(含量差值大于2.0以上的)的差異蛋白點(diǎn)回收后委托廣州慧晶生物科技有限公司進(jìn)行MALDI-TOF-TOF/MS質(zhì)譜分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 雄蕊原基分化期

對(duì)甜菜雄蕊原基分化期花蕾蛋白的差異進(jìn)行分析，在不育系中檢測(cè)到蛋白點(diǎn)405個(gè)，保持系中檢測(cè)到325個(gè)(如圖1)，檢測(cè)出的差異蛋白總數(shù)在不育系中升高的有14個(gè)點(diǎn)，在保持系中升高的有8個(gè)點(diǎn).

圖1 不育系DY5-CMS及其保持系DY5-O的1期花蕾蛋白2DE圖譜

利用PMF分析獲得質(zhì)譜圖(見(jiàn)圖2、3)，去除假陽(yáng)性點(diǎn)后，鑒定出6種蛋白(見(jiàn)表1)，即NADH脫氫酶、二硫辛酰胺脫氫酶、可溶性無(wú)機(jī)焦磷酸酶、ATP合成酶的β亞基和ATP合成酶D鏈、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白同系物.

圖2 雙向電泳圖譜中蛋白點(diǎn)B05的肽質(zhì)量指紋圖

圖3 B05胰蛋白酶酶解后肽段NQⅠDEⅠVLVGGSTR的MS/MS質(zhì)譜圖

表1 DY5-CMS和DY5-O 1期差異蛋白的PMF數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定結(jié)果

2.2 四分體時(shí)期

對(duì)甜菜四分體時(shí)期花蕾蛋白的差異進(jìn)行分析，在不育系中檢測(cè)到蛋白點(diǎn)385個(gè)，保持系中檢測(cè)到306個(gè)(如圖4)，檢測(cè)出2.0倍表達(dá)量以上的差異蛋白在DY5-O中有5個(gè)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，在DY5-CMS中有11個(gè)點(diǎn)表達(dá)上調(diào).利用MALDITOF-MS分析去除假陽(yáng)性點(diǎn)后，鑒定出4個(gè)蛋白.且這4個(gè)蛋白均在不育系中表達(dá)上調(diào)(見(jiàn)表2).

圖4 不育系DY5-CMS及其保持系DY5-O的2期花蕾蛋白2DE圖譜

表2 DY5-CMS和DY5-O 2期差異蛋白的PMF數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定結(jié)果

2.3 單核期

對(duì)甜菜單核時(shí)期花蕾蛋白的差異進(jìn)行分析，在不育系中檢測(cè)到蛋白點(diǎn)460個(gè)，保持系中檢測(cè)到508個(gè)，檢測(cè)出2.0倍表達(dá)量以上的差異蛋白總數(shù):從3期中找到24個(gè)差異點(diǎn)，其中在DY5-O中有16個(gè)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，在DY5-CMS中有8個(gè)點(diǎn)表達(dá)上調(diào).利用MALDI-TOF-MS分析去除假陽(yáng)性點(diǎn)后，鑒定出6個(gè)蛋白(見(jiàn)表3).

表3 DY5-CMS和DY5-O 3期差異蛋白的PMF數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定結(jié)果

3 討論

3.1 雄蕊原基分化期花蕾育性蛋白差異分析

從甜菜不育系及保持系1期花蕾蛋白中鑒定出6個(gè)差異蛋白，其中不育系中有NADH脫氫酶、二硫辛酰胺脫氫酶、可溶性無(wú)機(jī)焦磷酸酶、ATP合成酶的β亞基及ATP合成酶的D鏈5個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，這5個(gè)蛋白均與呼吸和能量代謝有關(guān).在保持系中只檢測(cè)出葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78表達(dá)上調(diào).

NADH脫氫酶是線(xiàn)粒體呼吸鏈的重要組成部分，在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)中起著重要作用.ATP合成酶是高等植物細(xì)胞內(nèi)最大的酶系之一，可以合成ATP為代謝活動(dòng)提供能量.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的5種與能量代謝有關(guān)的蛋白均在不育系中表達(dá)上調(diào)，推測(cè)ATP合成酶被水解導(dǎo)致能量供應(yīng)不足，促使雄性不育系植物中與能量代謝有關(guān)酶的表達(dá)量上調(diào).因此，推測(cè)這些與呼吸及能量代謝有關(guān)的蛋白與甜菜的細(xì)胞質(zhì)雄性不育有關(guān).

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上一種重要的分子伴侶，能阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)新生肽聚集，并輔助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新生肽形成正確構(gòu)象;GRP78還是一種鈣結(jié)合蛋白，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài).本實(shí)驗(yàn)只在甜菜的保持系DY5-O中發(fā)現(xiàn)了該蛋白，而在不育系DY5-CMS中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，推測(cè)在不育系中該酶的缺失導(dǎo)致花粉發(fā)育過(guò)程中的代謝紊亂，最終導(dǎo)致不育現(xiàn)象的產(chǎn)生.

3.2 四分體時(shí)期花蕾育性蛋白差異分析

從甜菜DY5-CMS及DY5-O的四分體時(shí)期花蕾蛋白中找到4個(gè)差異蛋白，分別為順烏頭酸酶、抗壞血酸過(guò)氧化物酶、延伸因子2及半胱氨酸合成酶.他們與甜菜的雄性不育有關(guān).

順烏頭酸酶(aconitase，ACO)是三羧酸循環(huán)中能量轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要控制酶.在介導(dǎo)植物抗病、氧化脅迫和調(diào)控細(xì)胞死亡方面具有重要作用.張明珠等［16］發(fā)現(xiàn)順烏頭酸酶基因在殺雄劑SQ-1誘導(dǎo)小麥雄性不育花藥中的表達(dá)，在生理型不育花藥發(fā)育的單核早期cACO基因表達(dá)水平與同期可育花藥相比顯著升高，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果恰好吻合.

抗壞血酸過(guò)氧化物酶是葉綠體中清除H2O2的主要酶，在鹽漬、熱休克等逆境條件下均易導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平和活性提高，但在本實(shí)驗(yàn)中其對(duì)育性生理生化的影響有待進(jìn)一步研究.

延伸因子(elongation factor)是參與蛋白翻譯延伸的重要蛋白質(zhì).研究發(fā)現(xiàn)，延伸因子在原核生物以及植物線(xiàn)粒體和質(zhì)體等細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成延伸階段發(fā)揮著重要的作用，在生長(zhǎng)信號(hào)傳導(dǎo)、抗旱、抗病等方面也有重要作用［17］.

3.3 單核期花蕾育性蛋白差異表達(dá)分析

在甜菜的3期花蕾中鑒定出的7個(gè)蛋白中，有5個(gè)是與植物光合作用有關(guān)的蛋白，分別是H型硫氧還蛋白 1、核酮糖 1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)大亞基、景天庚糖-1，7-二磷酸酶、氧增強(qiáng)蛋白1和光敏色素A，這些蛋白均在植物的光合作用中起著重要作用.另外2個(gè)分別是脂肪氧化酶(LOX)和RNA依賴(lài)的RNA聚合酶.

硫氧還蛋白可以通過(guò)還原靶蛋白中的二硫鍵參與細(xì)胞的一系列生化反應(yīng).在光合器官內(nèi)，葉綠體鐵氧還蛋白/硫氧還蛋白(Fd/Trx)參與葉綠體中還原磷酸戊糖途徑酶的激活、氧化磷酸戊糖途徑酶的暗激活等酶活性的調(diào)節(jié)［18］.本實(shí)驗(yàn)表明硫氧還蛋白在甜菜不育系3期花蕾中表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明在甜菜不育系的花藥發(fā)育至此期該酶起到一定的作用.

核酮糖 1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)能催化光合作用的二氧化碳固定反應(yīng).該類(lèi)蛋白的差異表達(dá)普遍存在于植物雄性不育系和保持系或不育系和轉(zhuǎn)換系之間，在水稻、蘿卜、小麥、甘藍(lán)、番茄、煙草等植物雄性不育中均檢測(cè)到Rubisco的功能缺陷或下調(diào)［19-20］.本實(shí)驗(yàn)在甜菜保持系的花蕾中也檢測(cè)到這種蛋白，而在不育系中缺失.推測(cè)Rubisco在不育系中缺失影響發(fā)育過(guò)程中糖和蛋白質(zhì)含量，而糖和蛋白質(zhì)代謝的失調(diào)與不育系花藥中小孢子的敗育有關(guān).花粉敗育的同時(shí)營(yíng)養(yǎng)代謝紊亂，合成受阻，分解加劇，影響雄性器官的發(fā)育，最終導(dǎo)致不育.

景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(SBPase)在植物光合作用卡爾文循環(huán)過(guò)程中控制著碳的流入和再生，對(duì)核酮糖-1，5-二磷酸的再生也起著重要作用.SBPase活性的改變會(huì)影響植物的生殖生長(zhǎng)，如表現(xiàn)出開(kāi)花延遲，開(kāi)花數(shù)減少的現(xiàn)象［21］.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在甜菜的保持系中SBPase的表達(dá)上調(diào)，推測(cè)不育系中SBPase缺失影響了核酮糖-1，5-二磷酸的再生，進(jìn)而影響花粉的敗育.

氧增強(qiáng)蛋白1(oxygen-evolving enhancer protein 1，OEE1)是由核基因錳簇穩(wěn)定外周蛋白PsbO基因編碼的定位于葉綠體上的蛋白.在甜菜不育系的單核時(shí)期花蕾中該蛋白表達(dá)下調(diào)，其作用機(jī)理尚不明確.

光敏色素是一種色素蛋白復(fù)合體，可以調(diào)節(jié)開(kāi)花，還能控制性別表達(dá)和育性的轉(zhuǎn)變.光敏核不育水稻在長(zhǎng)日照下雄性不育，在短日照下可育.光敏色素通過(guò)調(diào)節(jié)光周期參與光敏水稻的雄性器官發(fā)育和育性轉(zhuǎn)變，本實(shí)驗(yàn)在保持系中檢測(cè)到的光敏色素A在不育系中表達(dá)下調(diào)或缺失，推測(cè)光敏色素A是與雄性不育有關(guān)的蛋白之一.

RNA依賴(lài)的RNA聚合酶(RDR)通過(guò)基因沉默途徑參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)、逆境應(yīng)答以及表觀遺傳修飾等生物學(xué)過(guò)程.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RDR在不育系甜菜的3期花蕾中表達(dá)下調(diào)或缺失，推測(cè)不育系中RDR的表達(dá)下調(diào)或缺失可能對(duì)甜菜不育系花粉敗育后期有影響.

4 結(jié) 論

1)雄蕊原基分化期，找到6個(gè)與雄性不育有關(guān)的蛋白，其中5個(gè)蛋白還與能量和呼吸代謝有關(guān)，即NADH脫氫酶、二硫辛酰胺脫氫酶、可溶性無(wú)機(jī)焦磷酸酶、ATP合成酶的β亞基和ATP合成酶D鏈.這5個(gè)蛋白均在不育系中表達(dá)上調(diào)，只有一個(gè)在保持系中表達(dá)上調(diào)的蛋白是葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78.

2)四分體時(shí)期，分別是順烏頭酸酶、抗壞血酸過(guò)氧化物酶、延伸因子2及半胱氨酸合成酶可能與雄性不育有關(guān).這些蛋白均在不育系中表達(dá)上調(diào).

3)單核時(shí)期，篩選出6個(gè)可能與育性有關(guān)的蛋白.其中只有硫氧還蛋白在不育系中表達(dá)上調(diào)，其余5個(gè)蛋白均在保持系中表達(dá)上調(diào).

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