楊昌貴，江維克*，周 濤，肖承鴻，艾強(qiáng)，張代金

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002；2.貴州三元太寶實(shí)業(yè)有限公司，貴州 施秉 556200)

不同種源太子參中多糖和氨基酸含量的比較研究△

楊昌貴1，江維克1*，周 濤1，肖承鴻1，艾強(qiáng)1，張代金2

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002；2.貴州三元太寶實(shí)業(yè)有限公司，貴州 施秉 556200)

目的：通過對(duì)9個(gè)太子參種源的多糖和17種氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，考察同一種源在不同環(huán)境和不同管理模式下多糖和氨基酸含量變化，研究影響太子參質(zhì)量的主要因素。方法：采用顯色比色法測(cè)定多糖含量，采用柱前衍生化-HPLC法測(cè)定17種氨基酸含量。結(jié)果：太子參9個(gè)種源間藥材的多糖含量差異比較大，其中貴州施秉逸生種源和安徽種源的多糖含量超過50%。太子參9個(gè)種源間藥材的總氨基酸和人體必需氨基酸含量差異不大，不同的氨基酸在不同種源中的含量差異卻較大，其中精氨酸和天門冬氨酸在不同種源藥材中的含量均較高，9個(gè)種源藥材中的平均含量分別為2.49%和1.41%。結(jié)論：多糖含量可以作為太子參種源篩選、栽培環(huán)境和管理方式考察的指標(biāo)；太子參中氨基酸含量主要與繁殖方式有關(guān)。

太子參；種源；多糖含量；氨基酸含量

太子參為石竹科Caryophyllaceae植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根，具有益氣健脾、生津潤(rùn)肺之功效[1]。現(xiàn)代化學(xué)與藥理研究表明，太子參中含有三萜皂苷、多糖等化學(xué)成分，具有改善慢性心衰、改善記憶、降糖、抗氧化等藥理作用[2-6]。

自20世紀(jì)90年代初貴州施秉縣從福建柘榮縣成功引種了太子參后，在施秉及其周邊地區(qū)逐漸形成了規(guī)模種植，隨著太子參保健食品的開發(fā)利用，貴州太子參的種植規(guī)模也在不斷擴(kuò)大。近30年來，由于各種植企業(yè)和種植戶相繼從安徽、江蘇、福建等地區(qū)引進(jìn)了10多批栽培和野生種源，造成施秉太子參種源混雜，質(zhì)量參差不齊。選擇合適、優(yōu)良的種質(zhì)資源進(jìn)行種植，可以從源頭上保證太子參藥材的品質(zhì)。

本文在前期研究太子參不同栽培類型、不同繁殖方式、不同采收期生物量次生代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律[7-8]和建立太子參種質(zhì)資源圃的基礎(chǔ)上，以多糖和氨基酸含量為營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)，對(duì)9個(gè)太子參種源進(jìn)行檢測(cè)比較，同時(shí)考察同一種源在不同環(huán)境和管理下的營(yíng)養(yǎng)組分的含量變化，旨在為太子參種植中選擇適宜種源提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

9個(gè)種源的太子參樣品采集自2012年7月于貴州省施秉縣“貴州三元太寶實(shí)業(yè)股份有限公司”的太子參種質(zhì)資源圃(海拔946 m，N 27°08′21.0″，E 107°56′0.10″)。同時(shí)以2、5、7號(hào)種源為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別考察同一種源在人工管理與自然逸生條件、大田開曠與林下陰蔽環(huán)境、有性與無性種植后藥材多糖與氨基酸含量的差異水平。每份材料分別采集10株塊根，洗凈，≤ 50 ℃烘干，混合粉碎，備用。

表1 實(shí)驗(yàn)材料信息

1.2 儀器和試劑

紫外可見分光光度計(jì)(CBC Cintra20型，澳大利亞照生公司)；高效液相色譜儀(日本島津LC-20AD)；電子分析天平(EL-104型，梅特勒-托利多儀器有限公司)。葡萄糖對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-200904)；氨基酸測(cè)定試劑包(天津博納艾杰爾科技有限公司，包括：三乙胺，異硫氰酸苯酯，正亮氨酸)，氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(天津博納艾杰爾科技有限公司，含17種氨基酸，除胱氨酸為1.25 μmol·mL-1外，其余氨基酸都是2.5 μmol·mL-1)；乙腈(色譜純，Dikma Technologies INC.美國(guó))；無水乙醇、鹽酸、濃硫酸(分析純，上海申博化工有限公司)。

2 方法

2.1 太子參中多糖測(cè)定的方法

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取無水葡萄糖對(duì)照品，加蒸餾水制成濃度為44.36 μg·mL-1、35.488 μg·mL-1、26.616 μg·mL-1、17.744 μg·mL-1、8.872 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，分別取2 mL，依次加入苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL，加熱15 min，冰浴10 min，室溫下于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)，得回歸方程：A=0.06X+0.050 1，r=0.999 7。

2.1.2 樣品溶液的制備 精密稱取樣品粗粉0.1 g，用80%乙醇提取1 h，藥渣用蒸餾水90 ℃提取1 h，過濾，藥渣加蒸餾水洗滌數(shù)次，洗液并入濾液，蒸餾水定容于100 mL。再取50 mL加蒸餾水定容于100 mL備用。

2.1.3 多糖的含量測(cè)定 精密吸取樣品溶液0.5 mL，加蒸餾水至2.0 mL；吸取兩個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液2.0 mL，按2.1.1項(xiàng)下，自“依次加入1.0 mL苯酚試液”起操作，并按多糖含量(%)=[(0.0607A-0.0001)× f/W]×100計(jì)算。A為樣品測(cè)定吸光度平均值，W為樣品稱樣量(g)，f為多糖換算因子(f=2.38)。結(jié)果見表5、圖2。

2.1.4 精密度測(cè)定 精密吸取對(duì)照品溶液2.0 mL，按2.1.1項(xiàng)下，測(cè)定6次，吸光度的RSD 為0.08%，說明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取樣品0.1 g，照2.1.2和2.1.3項(xiàng)下操作，分別于0，30，60，90，150 min測(cè)定吸光度。結(jié)果RSD值為3.14%，說明在150 min內(nèi)樣品具有良好的穩(wěn)定性。

2.1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一樣品5份，每份0.1 g，照2.1.2和2.1.3項(xiàng)下，測(cè)定吸光度。結(jié)果RSD值為3.21%，說明方法的重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一產(chǎn)地6份樣品，每份0.05 g，加入適量葡萄糖對(duì)照品，照2.1.2和2.1.3項(xiàng)下，測(cè)定吸光度。計(jì)算結(jié)果見表2。

表2 太子參中多糖成分的加樣回收率試驗(yàn)

2.2 氨基酸的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 VenusilAA氨基酸分析專用柱(4.6×250 mm，5 μm，柱號(hào)：AA952505-0)；以醋酸鈉水溶液為流動(dòng)相A，以80%乙腈水溶液為流動(dòng)相B，按表3進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫為40℃；流速為1.0 mL·min-1。見圖1。

表3 太子參氨基酸成分的梯度洗脫條件表

A.對(duì)照品 B.樣品 1.天門冬氨酸(Asp) 2.谷氨酸(Glu) 3.絲氨酸(Ser) 4.甘氨酸(Gly) 5.組氨酸(His) 6.精氨酸(Arg) 7.蘇氨酸(Thr) 8.丙氨酸(Ala) 9.脯氨酸(Pro) 10.酪氨酸(Tyr) 11.纈氨酸(Val) 12.蛋氨酸(Met) 13.胱氨酸(Cys) 14.異亮氨酸(Ile) 15.亮氨酸(Leu) 16.正亮氨酸(Nle，內(nèi)標(biāo)物) 17-苯丙氨酸(Phe) 18賴氨酸(Lys)圖1 太子參氨基酸高效液相色譜圖譜

2.2.2 樣品處理 取樣品粉末0.5 g，精密稱定，置安瓿瓶中，精密加入0.1%苯酚的6 moL·L-1鹽酸10 mL，110 ± 1 ℃水解24 h，取出過濾，取濾液5 mL蒸干，殘?jiān)诱麴s水5.0 mL溶解，用0.45 μm濾膜過濾后，備用。

2.2.3 衍生化反應(yīng) 精密量取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液2.0 mL，加正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液0.20 mL，三乙胺乙腈溶液1 mL、異硫氰酸苯酯乙腈溶液1.0 mL，室溫放置3 h，然后加入正己烷4.0 mL，放置10 min，取下層溶液，用0.45 μm濾膜過濾，取濾液2.0 mL，加水定容至10 mL，即得。2.2.4 測(cè)定 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定。氨基酸含量(%)=f1C V×10-4/f2W。f1=樣品溶液中各氨基酸峰面積/內(nèi)標(biāo)物峰面積；f2=氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中各氨基酸峰面積∕內(nèi)標(biāo)物峰面積；C=氨基酸對(duì)照品濃度(μg·mL-1)，V=樣品溶液定容體積，W=樣品質(zhì)量(g)。結(jié)果見表5、圖3。

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別取混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL、150 μL、200 μL、250 μL、300 μL、350 μL、400 μL按2.2.3和2.2.4項(xiàng)下測(cè)定。以各氨基酸峰面積Y為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。除胱氨酸在0.125～0.500 μmoL·mL-1外，其余氨基酸在0.25～1.00 μmoL·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。17種氨基酸的線性回歸方程及其相關(guān)系數(shù)r值見表4。

表4 17種氨基酸的線性回歸方程及r值

2.2.6 精密度測(cè)定 取氨基酸對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖。計(jì)算各氨基酸的峰面積，結(jié)果RSD為1.72%～4.02%，表明精密度良好。

2.2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一樣品5 份，精密稱定，按2.2.2和2.2.3 項(xiàng)下處理后測(cè)定，計(jì)算各氨基酸的峰面積，結(jié)果RSD值為0.75%～3.01%，重現(xiàn)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取衍生后的樣品溶液，放置0，2，4，6，8，10，12 h，分別測(cè)定，計(jì)算各氨基酸的峰面積，結(jié)果RSD值為1.08%～2.94%，說明樣品至少在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的太子參粉末0.25 g，按2.2.2、2.2.3項(xiàng)方法分別提取、衍生、進(jìn)樣，平行5次，計(jì)算各氨基酸的回收率。結(jié)果，17種游離氨基酸的平均回收率在86.25%～108.04%之間，RSD值在1.24%～2.93%之間。

表5 不同種源太子參中多糖和氨基酸的含量 /%

注：*人體必需氨基酸；**總氨基酸含量為以上各氨基酸含量之和

圖2 不同種源太子參多糖含量均值比較圖

圖3 不同種源太子參總氨基酸含量均值、必需氨基酸含量均值比較圖

3 結(jié)果與討論

藥用植物中的多糖類化合物具有多種藥理作用和生理活性，可作為滋補(bǔ)類中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，有研究認(rèn)為多糖的含量與藥材表面顏色、飽滿度有一定相關(guān)性[9，10]，多糖含量高的藥材性狀飽滿、光亮。本文測(cè)定的9個(gè)種源太子參塊根中的多糖含量為18.38%～64.95%，RSD值達(dá)到31.84%，表明種源間藥材中多糖含量的差異比較大。其中SB-02(貴州施秉，逸生)、SB-03(貴州施秉，栽培)和XZ-01(安徽宣州，栽培)多糖含量超過50%，明顯高于其他種源的多糖含量。說明盡管施秉不是太子參的傳統(tǒng)產(chǎn)地，也沒有野生太子參分布的記載，但現(xiàn)在市場(chǎng)上施秉太子參藥材品相得到廣泛認(rèn)可，可能與其多糖含量高有關(guān)；同時(shí)也說明施秉逸生和安徽種源是太子參良種篩選的潛在材料。

本文以SB-02(貴州施秉，逸生)植株和SB-03(貴州施秉，大田)植株為例，考查了同一種源在不同管理模式下塊根中多糖含量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SB-03(貴州施秉，大田)塊根不僅多糖含量高于SB-02(貴州施秉，逃逸)，而且塊根數(shù)與植株形態(tài)遠(yuǎn)甚于自然生境中的樣本，表明科學(xué)的人工管理可大幅促進(jìn)太子參多糖成分的積累和提高產(chǎn)量；以JR-03(江蘇句容，林下)與JR-02(江蘇句容，大田)種源為例，考查了同一種源引種后在不同生境中的多糖含量變化，結(jié)果顯示處于較遮陰環(huán)境的JR-04樣本的多糖含量不僅明顯高于開闊生境的JR-02樣本，而且生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，倒苗時(shí)間較后者植株延后約12～15 d。林光美等人研究認(rèn)為[11]，適當(dāng)?shù)恼陉幠軌蜓娱L(zhǎng)太子參植株的生長(zhǎng)期，可提高種植產(chǎn)量10%，本文的實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)結(jié)果與之一致，說明生境的適宜程度能影響太子參產(chǎn)量和質(zhì)量，比如適當(dāng)?shù)恼陉幠軌蛟黾又仓甓嗵堑姆e累；本文還發(fā)現(xiàn)XZ-02(安徽宣州，有性繁殖)有性繁殖塊根的多糖含量比XZ-01(安徽宣州，無性繁殖)無性繁殖塊根的略低，但差別不顯著，表明不同繁殖材料都是適于人工種植方式的。

氨基酸是動(dòng)植物體內(nèi)合成生物蛋白質(zhì)的主要原料，也是主要的營(yíng)養(yǎng)成分，某些氨基酸還能夠參與機(jī)體內(nèi)的代謝，在基因表達(dá)控制方面和激素一樣起著重要的作用。由于大多數(shù)氨基酸缺乏天然的紫外或熒光吸收，衍生色譜法測(cè)定氨基酸的含量已經(jīng)成為一種趨勢(shì)，利用異硫氰酸苯酯(PITC)和氨基酸的衍生反應(yīng)，生成穩(wěn)定的產(chǎn)物苯基硫酸鹽(PTC)-氨基酸，是柱前衍生化測(cè)定氨基酸含量的最具有吸引力的分析方法之一[12，13]。由于衍生化反應(yīng)時(shí)間對(duì)于測(cè)定的穩(wěn)定性有較大影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)衍生化反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果表明，衍生化時(shí)間應(yīng)大于2.5 h，本文測(cè)定時(shí)的衍生化反應(yīng)時(shí)間規(guī)定為3 h。

本文測(cè)定的9個(gè)種源12份材料的17種氨基酸，其中人體必需氨基酸8種。結(jié)果顯示，9個(gè)種源藥材的總氨基酸的含量為9.66%～11.95%，RSD值5.81%，人體必需氨基酸(8種)含量為3.19%～4.11%，RSD值7.69%，表明種源間總氨基酸和必需氨基酸含量差異不大。但17種氨基酸在9個(gè)種源12份材料中的含量差異大小不一，RSD值從4.10%至32.17%。同時(shí)，在考察不同生境對(duì)同一種源影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)SB-02(貴州施秉，逸生)和SB-03(貴州施秉，大田)、JR-03(江蘇句容，大田)和JR-04(江蘇句容，林下)這2種種源中17種氨基酸總含量和必須氨基酸的含量也基本一致，即同一種源的氨基酸類組分與含量受生態(tài)環(huán)境的影響不大。但考查同一種源不同繁殖方式的氨基酸含量水平，結(jié)果顯示XZ-02(安徽宣州，有性繁殖)的氨基酸的含量要高于XZ-01(安徽宣州，無性繁殖)。提示太子參氨基酸含量與種源和環(huán)境的關(guān)系不大，而與繁殖方式有一定的關(guān)系。比較有性繁殖和無性繁殖的植株生長(zhǎng)過程發(fā)現(xiàn)，有性繁殖幼苗較無性繁殖幼苗弱，兩種繁殖方式的植株生長(zhǎng)后期逐漸趨于一致，而最后產(chǎn)量相當(dāng)，提示有性繁殖種苗在生長(zhǎng)過程中應(yīng)該有較高的生理代謝活動(dòng)，因此氨基酸的含量較高。至于再利用F1塊根進(jìn)行無性繁殖后，氨基酸含量是否會(huì)降低，有待于進(jìn)一步的觀察。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：62.

[2] 余永邦，秦民堅(jiān)，余國(guó)奠.太子參化學(xué)成分、藥理作用及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究進(jìn)展[J].中國(guó)野生植物資源，2003，22(4)：1-3.

[3] 沈祥春，陶玲，彭佼，等.太子參對(duì)心肌梗死后慢性心衰大鼠心功能與基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2008，24(9)：1694.

[4] 李志華.太子參多糖對(duì)東莨菪堿所致小鼠記憶障礙的改善作用[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，30(19)：673.

[5] 夏倫祝，徐先祥，張睿.太子參多糖對(duì)糖尿病大鼠糖脂代謝的影響[J].中國(guó)藥業(yè)，2009，18(9)：17.

[6] 熊何健，龐杰，謝主興.太子參提取物體外抗氧化活性研究[J].南開大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，42(6)：37.

[7] 肖承鴻，江維克，周濤，等.太子參種子休眠機(jī)制和萌發(fā)特性的研究[J].中國(guó)中藥雜志，2012，37(14)：2067-2070.

[8] 肖承鴻，周濤，江維克，等.貴州栽培太子參主要農(nóng)藝性狀比較及相關(guān)性研究[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38(6)：812-816.

[9] 鐘方曉，彭廣芳，李貴海.山東太子參多糖對(duì)質(zhì)量的影響[J].中草藥，1997，28(7)：428-430.

[10] 晏春耕，曹瑞芳.太子參藥材性狀與多糖含量的研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，15(11)：81-83.

[11] 林光美，侯長(zhǎng)紅.小葉型太子參高產(chǎn)栽培配套技術(shù)的研究[J].中國(guó)中藥雜志，2006，31(15)：1294-1296.

[12] Bidlingmeyer B A，Cohen S A，Tarvin T L.Rapid analysis of amino acids using pre-column derivatization[J].J Chromatogr，1984，336(1)：93-104.

[13] Komarova N V，Kamentsev J S，Solomonova A P，et al.Determination of amino acids in fodders and raw materials using capillary zone electrophoresis[J].J Chromatogr B，2004，800：135-143.

Comparative analysis of polysaccharide and amino acid content in different provenances of Pesudostellaria heterophylla from Guizhou Province

YANG Changgui1，JIANG Weike1*，ZHOU Tao1，Xiao Chenghong，AI Qiang，ZHANG Daijin2

(1.GuiyangcollegeofTraditionalChineseMedicine，Guiyang550002，China；2.GuizhouSanyuanTaibaoCo.，Ltd.，Shibing556200，China)

Objective：To study the main influence factors of Pseudostellariae Radix quality by determining polysaccharide and amino acid inPesudostellariaheterophyllafrom 9 different provenances and cultivation way.Methods：The determination of polysaccharide used colorimetric method，the content of 17 kinds of amino acid used pre-column derivatization RP-HPLC method.Results：The contents of polysaccharide in the 9 different provenances had great difference，but the contents of amino acid had little difference.Conclusion：The contents of polysaccharide could be used as the best selection standards forP.heterophyllabreeding.

Pesudostellariaheterophylla；Provenances；Polysaccharide content；Amino acid content

施秉中藥材產(chǎn)業(yè)科技合作專項(xiàng)計(jì)劃(施科合專項(xiàng)(20010)02號(hào)、(2012)04號(hào))；貴州省教育廳自然科學(xué)項(xiàng)目(黔教科(2011)031號(hào))；中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目(20603020120，20603020223)；貴陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目(筑科合同[2011201]大—3號(hào)、[2012]3號(hào))；貴陽中醫(yī)學(xué)院研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(ZYYCX11033)

*[通信作者] 江維克，教授，研究方向：中藥資源、中藥栽培及中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)，Tel：(0851)5622506，E-mail：jwk_88@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.01.010

2013-05-20)