邱千，戴琪，陳樹和，干國平，劉焱文，卿國良

(1.華中科技大學 同濟醫(yī)學院 基礎(chǔ)醫(yī)學院 藥理學系，湖北 武漢 430030；2.湖北中醫(yī)藥大學 中藥資源與中藥化學省級重點實驗室，湖北 武漢 430061)

菝葜體外抗非小細胞肺癌細胞活性物質(zhì)研究△

邱千1，2，戴琪2，陳樹和2，干國平2，劉焱文2，卿國良1*

(1.華中科技大學 同濟醫(yī)學院 基礎(chǔ)醫(yī)學院 藥理學系，湖北 武漢 430030；2.湖北中醫(yī)藥大學 中藥資源與中藥化學省級重點實驗室，湖北 武漢 430061)

目的：篩選菝葜抗非小細胞肺癌細胞活性物質(zhì)。方法：采用溶劑法、明膠沉淀法和大孔吸附樹脂純化技術(shù)，將菝葜提取分離為乙醇粗提物、總鞣質(zhì)、總黃酮3個物質(zhì)部位，利用細胞計數(shù)儀測定3種物質(zhì)部位抗A549、NCI-H522、NCI-H23細胞存活率。結(jié)果：從菝葜提取分離的3種物質(zhì)部位均有不同程度抗非小細胞肺癌細胞活性，其中鞣質(zhì)部位致非小細胞肺癌細胞存活率最低，并在濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的計量依耐性。結(jié)論：鞣質(zhì)為菝葜主要抗非小細胞肺癌細胞活性物質(zhì)。

菝葜；非小細胞肺癌細胞；鞣質(zhì)；乙醇提取物；總黃酮

菝葜SmilaxchinaL.是百合科菝葜屬植物，其藥用部位為根莖，收載于《中國藥典》2010版一部，具有利濕去濁，祛風除痹，解毒散瘀的功能[1]。菝葜是中醫(yī)臨床治療腫瘤疾患的常用配伍組方藥味，如以菝葜為君藥的復方菝葜顆粒，對治療肺癌有一定療效[2]。前人報道了菝葜的黃酮類成分具有體外抗肺癌作用[3-4]，其鞣質(zhì)類成分抗肺癌生物活性尚未見文獻報道。筆者采用溶劑法、明膠沉淀法和大孔樹脂純化技術(shù)，將菝葜提取分離為乙醇粗提物、總鞣質(zhì)部位和總黃酮部位，對上述3種提取分離物質(zhì)的抗肺癌活性進行了比較研究。研究結(jié)果表明，菝葜鞣質(zhì)類成分為其主要抗肺癌活性物質(zhì)。

1 材料

1.1 藥材與試劑

菝葜藥材于2012年8月購自湖北福人藥業(yè)有限公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學藥學院張秀橋教授鑒定為菝葜SmilaxchinaL.的干燥根莖。

D101大孔樹脂(上海勁凱樹脂有限公司)，明膠(天津市博迪化工有限公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)，DMSO( 美國Sigma-Aldrich公司)，臺盼藍(美國Sigma-Aldrich公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，丙酮(天津市天力化學試劑有限公司)。

1.2 細胞株

非小細胞肺癌細胞A549、NCI-H522、NCI-H23(美國ATCC)。

1.3 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(三洋電機株式會社)，超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，電熱高壓蒸氣滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司)，倒置顯微鏡(安徽中科中佳科學儀器有限公司)，24孔細胞培養(yǎng)板(美國Costar公司)，細胞計數(shù)儀(上海睿玨生物有限公司)，電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

2 方法

2.1 供試藥物的制備

乙醇粗提物：稱取菝葜飲片1 kg，依次加入8倍量、6倍量60%乙醇回流提取2次，依次為2 h,1 h,合并提取液，回收乙醇，干燥。

總鞣質(zhì)部位：將上述回收乙醇后的提取液加入一定量4%明膠溶液，攪拌，靜置，過濾得到沉淀部分，加入適量丙酮，攪拌，靜置，濾除沉淀，濾液回收溶劑，干燥。

總黃酮部位：將上述明膠沉淀法所得濾液過D101大孔樹脂，依次用水、50%乙醇溶液洗脫，收集50%乙醇洗脫液，干燥得黃酮部位[5]。

將乙醇粗提物、總黃酮部位、總鞣質(zhì)部位溶解于DMSO后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度，備用。

2.2 供試品對體外培養(yǎng)腫瘤細胞生長的影響

A549、NCI-H522、NCI-H23細胞均為貼壁細胞，將復蘇好的細胞置于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2、相對濕度95%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細胞生長情況。A549細胞2～3 d傳代1次，NCI-H23和NCI-H522細胞3～4 d傳代1次。

將處于對數(shù)生長期的A549、NCI-H522、NCI-H23細胞，以每孔500 μL(分別約2.5×104個、4.5×104個、4.5×104個)接種于24 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，吸棄上清液，于上述24孔板中加入不同濃度的待測樣品液500 μL，每個濃度平行2孔。以0.1%DMSO作空白于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)移孔中細胞于EP管中，吹打混勻。吸取20 μL，加入等量0.4%臺盼藍，吹打混勻，用細胞計數(shù)儀測細胞存活率。實驗重復兩次，取平均值。

3 結(jié)果

菝葜提取物對A549、NCI-H522、NCI-H23 3種細胞生長的影響與對照組比較，菝葜鞣質(zhì)部位組致肺癌細胞的存活率最低，菝葜總鞣質(zhì)抗肺癌細胞活性優(yōu)于其乙醇粗提物和總黃酮，并具計量效應(yīng)關(guān)系，見圖1。

A.A549 B.NCI-H522 C.NCI-H23圖1 菝葜不同物質(zhì)部位對3種肺癌細胞存活率的影響

4 討論

菝葜是中藥復方臨床用于治療腫瘤疾患常用的配伍藥味。迄今文獻報道了菝葜黃酮類成分為其主要抗腫瘤活性物質(zhì)，并從中分離和篩選出多種抗腫瘤活性化合物[2-3]。筆者選取3種具有代表性的非小細胞肺癌細胞A549、NCI-H23及NCI-H522為實驗用細胞株，對菝葜乙醇粗提物、總鞣質(zhì)部位和總黃酮部位進行了抗肺癌細胞活性篩選。研究結(jié)果表明菝葜總鞣質(zhì)部位致3種肺癌細胞死亡率最高，且在濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的計量依耐性，說明菝葜鞣質(zhì)部位具有良好的體外抗非小細胞肺癌活性，從而為進一步詮釋菝葜治療肺癌的物質(zhì)基礎(chǔ)提供實驗依據(jù)，具有重要意義。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：290.

[2] 李廣誠，董克禮，朱宏.復方菝葜顆粒治療中晚期非小細胞肺癌的臨床研究[J].中國醫(yī)學工程，2007，15(3)：269-270.

[3] Wu Lisheng，Wang Xiaojing，JIA Aiqun.Cytotoxic polyphenols against breast tumor cell inSmilaxchinaL.[J].J Ethnopharmacol，2010，130：460-464.

[4] Li Yuanlii，Gan Guoping，Liu Yanwen，et al.A flavonoid glycoside isolated fromSmilaxchinaL.rhizome in vitro anticancer effects on human cancer cell lines[J].J Ethnopharmacol，2007，113：115-124.

[5] 于偉.菝葜抗炎有效部位及其軟膠囊制劑藥學研究[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學，2008.

Screening of anti-NSCLCC Components from Rhizomes of Smilax china L. in vitro

QIU Qian1，2，DAI Qi2，CHEN Shuhe2，GAN Guopin2，QING Guoliang1*，LIU Yanwen2*

(1DepartmentofPharmacology，SchoolofBasicMedicalSciences，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China2.ProvincialKeyLaboratoryofResourceandChemistryofChineseMedicine，HubeiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Wuhan430061，China)

Objective：To Screen anti-NSCLCC active components from the rhizomes ofSmilaxchinaL.Methods：Ethanol crude extracts，tannins and flavonoids were extracted and separated fromSmilaxchinaL.by using solvent method，gelatin precipitation and macroporous adsorption resin purification technology.The survival rates of A549、NCI-H522、NCI-H23 were measured by cell counting instrument.Results：All the extracts had different anti-NSCLCC activities，tannins showed the best activity against A549、NCI-H522、NCI-H23 cells and presented good dose-effect relationship.Conclusion：Tannins are the main anti-NSCLCC ingredients of the rhizomes ofSmilaxchinaL.

SmilaxchinaL.；NSCLCC；Tannins；Ethanol crude extracts；Flavonoids

國家自然科學基金項目(31270393)

*[通信作者] 卿國良，教授，博士生導師，腫瘤藥理學術(shù)帶頭人；E-mail：qingguoliang@mail.hust.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.01.004

2013-08-09)