李俊健，吳永成，宋粉云

(廣東藥學(xué)院 藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006)

HPLC測(cè)定戊己丸中4種生物堿類成分的含量△

李俊健，吳永成，宋粉云*

(廣東藥學(xué)院 藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的：建立測(cè)定戊己丸中4種生物堿類成分含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法，固定相為Diamonsil-C18柱，乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(48∶52)(每100 mL中加入十二烷基硫酸鈉0.4 g)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm，柱溫為25 ℃。結(jié)果：鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀分別在5.0～50.0，0.4～4.0，2.0～20.0，2.0～20.0 g·mL-1呈良好的線性關(guān)系；平均回收率分別為102.4%，100.1%，100.0%，102.0%；方法精密度RSD分別為0.36%，1.50%，1.60%，0.86%(n=6)。結(jié)論：該法可用于戊己丸的質(zhì)量控制。

戊己丸；鹽酸小檗堿；鹽酸表小檗堿；鹽酸黃連堿；鹽酸巴馬?。环聪喔咝б合嗌V法；含量測(cè)定

戊己丸是由黃連、吳茱萸(制)、白芍(炒)3味中藥制成的中藥成方制劑，具有瀉肝和胃，降逆止嘔之功效。臨床用于肝火犯胃、肝胃不和所致的胃脘灼熱疼痛、嘔吐吞酸、口苦嘈雜、腹痛泄瀉等癥的治療。其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用HPLC測(cè)定鹽酸小檗堿和芍藥苷的含量[1]。已有HPLC測(cè)定鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、吳茱萸堿和吳茱萸次堿等含量的報(bào)道[2-5]，但同時(shí)測(cè)定鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀的含量測(cè)定未見文獻(xiàn)報(bào)道。黃連為方中主藥，其主要成分為生物堿[6]，其中鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀為《中國(guó)藥典》2010年版黃連含量測(cè)定指標(biāo)成分[1]。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)戊己丸的質(zhì)量，筆者建立了戊己丸中鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀4種生物堿類成分含量測(cè)定的反相高效液相色譜法，具有分離效果好、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀(安捷倫公司)，Agilent 1100系列雙元泵，Agilent 1100可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，Agilent 1100/化學(xué)工作站；KQ-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，工作頻率100 kHz，輸出功率400 W。

鹽酸小檗堿對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110713-200609)，鹽酸表小檗堿對(duì)照品(上海華壹生物科技有限公司，經(jīng)峰面積歸一化法測(cè)定[1]，含量為98.2%)，鹽酸黃連堿對(duì)照品(上海華壹生物科技有限公司，經(jīng)峰面積歸一化法測(cè)定[1]，含量為98.3%)，鹽酸巴馬汀對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110732-201108)；戊己丸(李時(shí)珍醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)：201102001，201009007，201109008)。乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品12.5 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為250 μg·mL-1的鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液。精密稱取鹽酸黃連堿對(duì)照品10.2 mg、鹽酸巴馬汀對(duì)照品10.0 mg，分別置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀質(zhì)量濃度分別為100，100 μg·mL-1的對(duì)照品貯備液。精密稱取鹽酸表小檗堿對(duì)照品5.1 mg置250 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得鹽酸表小檗堿質(zhì)量濃度為20.0 μg·mL-1的對(duì)照品貯備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取約0.05 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-甲醇(1∶100)溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，續(xù)濾液0.45 μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照品溶液的制備 取處方組成中除黃連外的其余成分制成不含黃連的陰性對(duì)照品，按2.1.2項(xiàng)下的制備方法處理得陰性對(duì)照液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱為Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬公司)，乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀(48∶52)(每100 mL加0.4 g十二烷基硫酸鈉)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm，柱溫為室溫。分別取對(duì)照品溶液(鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度為20.0 μg·mL-1、鹽酸表小檗堿質(zhì)量濃度為1.6 μg·mL-1、鹽酸黃連堿質(zhì)量濃度為8.0 μg·mL-1、鹽酸巴馬汀質(zhì)量濃度為8.0 μg·mL-1)、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液10 μL注入液相色譜儀，理論板數(shù)以鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000，鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿保留時(shí)間分別為20.0，22.7，26.5，30.8 min，與其他組分峰的分離度大于1.5；陰性樣品不干擾樣品測(cè)定，見圖1。

1.鹽酸表小檗堿 2.鹽酸黃連堿 3.鹽酸巴馬汀 4.鹽酸小檗堿A.對(duì)照品 B.樣品 C.陰性對(duì)照品圖1 戊己丸及對(duì)照品HPLC圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 分別吸取一定量的對(duì)照品貯備液，加甲醇稀釋成鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度為5.0，10.0，20.0，40.0，50.0 μg·mL-1，鹽酸表小檗堿質(zhì)量濃度為0.4，0.8，1.6，3.2，4.0 μg·mL-1，鹽酸黃連堿質(zhì)量濃度為2.0，4.0，8.0，16.0，20.0 μg·mL-1，鹽酸巴馬汀質(zhì)量濃度為2.0，4.0，8.0，16.0，20.0 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液。依次進(jìn)樣10 μL，每個(gè)濃度測(cè)定3次以上。以峰面積(Y)對(duì)對(duì)照品溶液系列質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸，得鹽酸小檗堿回歸方程Y=20.69X-7.13，r=0.999 9；鹽酸表小檗堿回歸方程Y=63.27X+0.26，r=0.999 7；鹽酸黃連堿回歸方程Y=20.24X-4.11，r=0.999 8；鹽酸巴馬汀回歸方程Y=28.20X-4.20，r=0.999 9。表明鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀分別在5.0～50.0,0.4～4.0,2.0～20.0,2.0～20.0 μg·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀質(zhì)量濃度分別為20.0，1.6，8.0，8.0 μg·mL-1的對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)測(cè)定5次，其峰面積的平均值分別為401.5，103.0，157.1，220.0，RSD分別為1.06%，1.54%，0.75%，1.59%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(批號(hào)：201102001)在0，2，4，6，8，12 h 分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，結(jié)果鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀峰面積的平均值分別為639.0，114.5，156.1，171.6，RSD分別為1.83%，1.86%，1.58%，1.77%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(批號(hào)：201102001)樣品6份，按2.1.2方法提取、測(cè)定，結(jié)果鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀的平均含量分別為29.391，1.716，7.412，5.932 mg·g-1，RSD分別為0.36%，1.50%，1.60%，0.86%，表明分析方法精密度良好。

2.3.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)樣品(批號(hào)：201102001)約0.025 g共6份，加入相應(yīng)量的4種對(duì)照品貯備液，按2.1.2方法處理并測(cè)定，計(jì)算鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀的回收率，結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確可靠。見表 1～4。

2.4 樣品含量測(cè)定

取戊己丸樣品3批，照2.1.2方法制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算樣品中4種生物堿類成分的含量，結(jié)果見表5。

表1 戊己丸中鹽酸小檗堿回收率試驗(yàn)

表2 戊己丸中鹽酸表小檗堿回收率試驗(yàn)

表3 戊己丸中鹽酸黃連堿回收率試驗(yàn)

表4 戊己丸中鹽酸巴馬汀回收率試驗(yàn)

表5 戊己丸中樣品含量測(cè)定(n=3) /mg·g-1

3 討論

黃連及其制劑中生物堿類成分的提取溶劑一般為鹽酸-甲醇[1]，筆者參照文獻(xiàn)報(bào)道的戊己丸中鹽酸小檗堿提取方法[1]，以鹽酸-甲醇(1∶100)為溶劑進(jìn)行提取，比較了加熱回流與超聲提取對(duì)提取率的影響，并考察了超聲提取時(shí)間對(duì)提取的影響，最終確定超聲提取30 min，本法簡(jiǎn)單、提取率高。

黃連及其制劑中生物堿類成分的HPLC含量測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)主要采用345 nm和265 nm[1]。經(jīng)考察發(fā)現(xiàn)，在上述波長(zhǎng)下干擾較大，在284 nm下，4種生物堿的吸收都比較大，而且干擾小，故選擇284 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

黃連中生物堿屬于季銨堿，因此其測(cè)定采用離子對(duì)色譜法，流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑十二烷基硫酸鈉，參照文獻(xiàn)[1，7-8]考察了乙腈和磷酸二氫鉀的比例及十二烷基硫酸鈉的加入量對(duì)分離的影響，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀(48∶52)(每100 mL加0.4 g十二烷基硫酸鈉)為流動(dòng)相分離效果最好。

筆者采用離子對(duì)反相高效液相色譜法測(cè)定戊己丸中4種生物堿的含量，方法學(xué)驗(yàn)證表明，其精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性均能滿足定量的要求，故本方法可用于戊己丸的質(zhì)量控制。

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Determination of 4 Kind Alkaloids in Wuji Wan by HPLC

LI Junjian，WU Yongcheng，SONG Fenyun*

(SchoolofPharmacy，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China)

Objective：To establish a method for the determination of 4 kind alkaloids in Wuji Wan.Methods：HPLC method was established.The chromatographic column was Diamonsil-C18.The mobile phase was a mixture of acetonitrile-0.05 mol·L-1potassium dihydrogen phosphate(48∶52，V/Vcontaining 0.4 g sodium laurylsulfate per 100 mL).The flow rate was 1.0 mL·min-1，and the detection wavelength was 284 nm.Results：The calibration curves for berberine hydrochloride，epiberberine hydrochloric，coptisine hydrochloride，palmatine hydrochloride were linear in the concentration range of 5.0-50.0，0.4-4.0，2.0-20.0，2.0-20.0 g·mL-1，respectively.The average recoveries for berberine hydrochloride，epiberberine hydrochloric，coptisine hydrochloride，palmatine hydrochloride were 102.4%，100.1%，100.0%，102.0%，respectively.Precision of the method was 0.36%，1.50%，1.60%，0.86%(RSD，n=6)，respectively.Conclusion：The method can be used for quantitative determining of Wuji Wan.

Wuji Wan；Berberine；Epiberberine；Coptisine；Palmatine；RP-HPLC；Quantitative determining

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(5002841)

*[通信作者] 宋粉云，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：現(xiàn)代分析方法在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用研究；E-mail：fuhaiwu@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.01.014

2013-05-15)